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TEMA 5: TÉCNICAS DE OBSERVACION MICROSCÓPICA.
El origen de la microbiología esta ligado a los microscopios. La función del microscopio es que la luz que relaje ale objeto que vemos entre con un determinado ángulo para poder verlo en el tamaño deseado.Los microscopios se pueden clasificar atendiendo al nº de lentes en simples y compuestos, y en función del principio en el que se basa la amplificación en MO (luz visible: campo claro, campo oscuro, contraste de fases, tridimensional, interferencia, fuerza atómica y confocal), ME (haces de e⁻: transmisión y barrido) y MU (luz ultravioleta: fluorescencia)
Conceptos básicos de microscopia: Aumento: propiedad óptica s, aumenta el ángulo para que sea mayor de un grado, proporcionada por la lente objetivo y la lente ocular. contraste: se basa en Claridad o nitidez en las observaciones: no depende de las lentes sino de los métodos de tinción, de la longitud de onda y de los aumentos. Si esta no es buena por mucho que ampliemos la imagen, esta se seguirá viendose distorsionada en proporción al aumento que le apliquemos. Para mejorar esta debemos bajar la longitud de onda o aumentar el indice de refracción y así mejorar la claridad del microscopio. Contraste: solo se puede observar los objetos cuando nos encontramos el objetos en un medio diferente. Poder resolución: es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como separados. Es longitud de onda entre 2AN (AN= índice de refracción (en el aire es 1) por el seno de un ángulo que forma). El valor numérico es inversamente proporcional a la claridad o nitidez del microscopio, es decir, cuanto menor sea el poder de resolución, mayor será la claridad. Nuestro sistema óptico no refleja realmente la realidad, debido a que el ojo ve las cosas con un ángulo de incidencia, si lo acercamos el mismo objeto lo vemos más grande ya que el ángulo de la entrada es mayor, es decir alfa es mayor, funciona así hasta un determinado punto debido a que tiene una limitación de 25cm donde no podemos enfocar bien el objeto, los microorganismos son invisibles debido al tamaño, el tamaño medio de un objeto que se pueden observar a 25 cm es de 1mm, los de menor tamaño no se pueden observar a simple vista, el ángulo que nos entra en el ojo algo invisible es con un grado de incidencia de menor de 1º. Las lentes de los microscopios provoca un aumento del ángulo de estrada.
PREGUNTA: Se observa en un objeto con un semiángulo de 55º y un índice de refracción1,52º, con una luz verde azul de 500 nm ¿Sería posible observar un objeto de una micra? El poder resolución es de 200 nm, lo que equivale a 0,2 micras, por lo que si se podría ver un objeto de una micra incluso 5 veces más pequeño.
Los diferentes tipos de microscopios se pueden clasificar según: La longitud de onda: Ópticos: hay varios tipos: microscopio de fondo claro, microscopio de fondo oscuro(no necesita tinciones), de contraste de fases (no necesita tener la muestra teñida, tiene un dispositivo llamado Zarnike que envía la luz de tal manera que detecta variaciones del índice difracción diminutas que distingue entre los rayos de sol que han atravesado algo y lo que no dando lugar a un contraste), luz ultravioleta(longitud de onda pequeña menor que el campo visible, hay dos tipos el normal (luz ultravioleta y otro de lentes de cuarzo,
utilizando estas lentes con dispositivos para ver la luz ultravioleta ya que es muy potente, la muestra se ve en una pantalla que generan los rayos ultravioletas), fluorescencia ¿¿¿¿¿también usa la luz ultravioleta pero si se puede ver la imagen, la luz ultravioleta no se puede debido a que emite desde abajo sin por encima de muestra de forma oblicua pero no se veria nada pero por ello se tiene que teñir con florescencia como rrdamina.isotiscinato de florescencia que emite la luz visible????, microscopio de inmunofluorescencia que tiñen los anticuerpos.
Tipos de microscopía óptica:
• MO de campo claro: es el microscopio mas usado y esta compuesto por 2 series de lentes
(objetivos y oculares) que funcionan conjuntamente para producir la imagen. Las muestras se visualizan al destacar sobre un fondo iluminado. El fondo es claro y la muestra a ver se contrasta mediante tinciones. Utiliza también aceite de inmersión para disminuir el PR. En la base hay una fuente de luz. En el brazo hay dos dispositivos giratorios para enfocar, de ajuste fino (micrométrico) y ajuste grueso (macrométrico), que pueden mover la platina o portaobjetos para enfocar la imagen. El condensador se monta dentro o por debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos.
• MO de campo oscuro: la luz incide sobre la muestra solo desde los lados.Posee un diafragma y un
condensador especiales.Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de modo que solo la luz reflejada o refractada por la muestra interrumpiendo el paso de la luz puede formar una imagen.El fondo aparece negro, mientras que el objeto queda iluminado. Efecto tindal. Linea de luz entra en apagado y vemos particulas flotando, tipico polvo que flota. Si nos pusieramos en el rayo podriamos verlo, pero podemos ver su perperndicularidad y las particulas que hay en el.La resolución es muy alta.Permite el examen de los microorganismos sin teñir, observar su movilidad y ver estructuras internas de eucariotas.
• MO de contraste de fases: permite visualizar células sin necesidad de tinción. Fondo brillante.Tiene
un condensador con diafragma anular que produce un cono hueco de luz. Objetivo con anillo de fase en una placa cambiadora de fase. Las células poseen un n distinto al del medio y desvían los rayos de luz que las atraviesan. La luz que pasa a través de de una muestra sufre un retardo (imagen oscura sobre un fondo brillante). Permite observar montajes húmedos, detectar endosporas y cuerpos de inclusión y estudiar células eucariotas.
• MO de interferencia diferencial: crea una imagen sobre la base de la detección de diferencias en
los n y el espesor de la muestra. Unos prismas generan 2 ondas de luz polarizada plana en ángulo recto una respecto de la otra. Una de las ondas pasa a través de la muestra y la otra sirve de referencia y pasa por una zona clara. Tras atravesar la muestra las 2 ondas se combinan e interfieren entre sí, llegan desfasadas al ojo y forman una imagen tridimensional. Si no hay muestra los 2 haces llegan al mismo tiempo. Estructuras como paredes celulares, endosporas, gránulos, vacuolas y núcleo de eucariotas aparecen claramente visibles.
• MO de fuerza atómica: se fundamenta en las interacciones atómicas de las partículas de la
muestra que son captadas por un dispositivo situado muy cerca de la muestra (viva). Se trata de una sonda que se va moviendo sobre la muestra y recoge datos de las repulsiones atómicas (ondas desprendidas). Todo lo que detecta el dispositivo se transmite a través de un sistema informático y en una pantalla se muestran los resultados tridimensionales.
Realiza un escáner con un estrecho haz de e⁻ en forma de prisma, de adelante hacia atrás sobre la muestra. Cuando el haz incide sobre una zona concreta de la muestra, los átomos de la superficie emiten una nube de e- que son atrapados por un detector especial. Inciden sobre un centelleador, causando la emisión por éste de centelleos de luz que un fotomultiplicador transforma en una corriente eléctrica y la amplifica. La señal se envía a un tubo de rayos catódicos y se produce una imagen como en la pantalla de televisión, que puede verse y fotografiarse. Sólo permite ver superficies.
Se pueden encontrar otros tipos de microscopios menos usuales: Microscopio de interferencia o de contraste diferencial que utiliza luz polarizada, que vibra en un solo plano haciendo pasar por un prisma la luz polarizada atravesando la muestra por distintos sitios que se polarizan o no, después de atravesar la imagen no están todos en la misma fase originando la imágenes con relieve. Fuerza atómica:dispositivo con un sensor que pasa por la muestra, detecta la fuerzas atómicas repulsivas, que se genera una imagen. Confocal: crea imagenes tridimensionales, utilizando luz que se utiliza es rayo láser, que recorre la muestra por cada plano, que se reconstruye la imagen tridimensional por todos los planos.
ASPECTO MO ME
Aumento práctico mayor 1000-1500 > 100000 Resolución máxima 0,2μm 0,05nm hasta 0, Fuente de radiación luz visible haces de e⁻
Lentes de vidrio
electromagnéticas colocadas simétricamente respecto al eje axial que enfoca el haz de e⁻, a través de un tubo en el que se ha hecho vacío, sobre la muestra (una sección ultrafina).
Fuente de contraste absorción de luz diferencial dispersión de e⁻
Medio de desplazamiento aire alto vacío
Montaje de la muestra portaobjetos
rejillas metálicas. Tratamiento previo de las muestras: fijación, deshidratación, inclusión con resina (polimerización), corte con ultramicrotomo (0,1-0,5nm), aumento de contraste con metales pesados y montaje sobre rejillas de Cu.
Colorantes utilizados en las tinciones: Colorantes: son compuestos químico orgánicos empleados para la tinción, presenta dos partes:
• Cromóforo que da lugar al color, como por ejemplo los grupos nitros
• Auxocromo, es la parte reactiva que hace que se una a diferentes estructuras. Actúa de puente entre la
estructura celular y el cromóforo.
Según el comportamientos químicos se pueden clasificar en: -Ácido : el auxocromo es un anión (carga neta negativa) como la eosina, roja congo o la fuscina. Se unen a estructuras con carga positiva. -Básico: el axocromo es un catión (carga neta positiva) como el azul de metileno,cristal violeta, safranina. Se unen a estructuras con carga negativa. -Neutros: son sales de colorantes ácidos y básicos que se combinan entre si. tinciones.
Hay 3 tipos de tinciones: -Simple o directa: emplea solo un colorante y tiñen por igual toda la bacteria. -Negativas o indirectas: no es una verdadera tinción, se tiñe el medio y no la bacteria dando lugar a un contraste, como nigrosina que no entra dentro de la muestra, tiñe el medio de negro es similar a la microscopia de fondo oscuro. -Diferenciales: se emplee más de un colorante ,las células que se tiñen de manera diferente dependiendo del tipo de microorganismo. Hay dos tipos diferenciales más importantes:
• GRAM: es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un
método de tinción diferencial que divide a las bacterias en dos clases: Gram+ y Gram-. Se basa en la naturaleza de la pared celular. En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con cristal de violeta durante 2 minutos. Se tira el exceso y se aplica una solución yodoyodurada o Lugol- Yodo (actúa como mordiente; intensifica la tinción) durante 1 minuto, se tira el exceso y se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo con safranina, se aclara con H₂O y se seca. Al darle cristal de violeta ( CV ) se forman complejos de este tinte en el interior de las células. Luego el Lugol-Yodo hace que se fije más la unión del CV con la célula, formando un complejo llamado CV-I, que es más insoluble en H₂O y en alcohol. Las células se decoloran dependiendo de su porosidad. En unos casos se extrae CV-I y en otros no. La decoloración de contraste ( safranina ) se utiliza para células a las que se ha extraído CV-I. Gram posciticas de color morado y las gram negativas de color rosa.
• TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE: es otro método importante de tinción diferencial.
Hay algunas bacterias difíciles de teñir, pero que una vez teñidas es difícil decolorarlas. Se trata de teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol ( método de Ziehl-Neelsen ). Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica, permaneciendo de color rojo. Se diferencian 2 tipos de células:
- Ziehl-Neelsen positivas: moradas, no se decoloran
- Ziehl-Neelsen negativas: azules, se decoloran. Todas las ZN+ son Gram+, pero no todas las Gram+ son ZN+.
-Específicas o selectivas: no tiñen toda la células, sino solo partes especificas: como con presencia de cápsulas, flagelos (el flagelo se engrosa mediante una tinción específica,el método utilizado es Leifsen) ,gránulos de volutina. o corpúsculo metacromático mediante tinción Wirtz.
• en muchos patógenos tiene componentes que contribuyen a su patogenicidad.
• protege a la célula frente a sustancias tóxicas y es lugar de acción de varios antibióticos.
• punto de anclaje para los flagelos.
*la penicilina inhibe la transpeptidizacion. Produce la lisis de la pared celular e impide la síntesis de la misma. La pared protege frente a la penicilina. La mayoría de las bacterias poseen pared celular. La penicilina rompe las interacciones en periodo de crecimiento o lo que ya esta formado???? Composición y estructura: el PG (macromolécula asociada a la pared celular) tiene una distribución prácticamente universal salvo excepciones como la de las arqueas, y la de los micoplasmas, que no tienen pared, y algunas otras bacterias (pocas) que tienen pared pero sin PG ( Planctomyces, Pasteuria).
Las bacterias Gram+ tienen entre 20 y 80nm de PG unido a la membrana plasmática. Las bacterias Gram- tienen entre 2 y 7nm de PG, junto con la membrana plasmática, otra membrana, y el espacio periplásmico. Espacio periplásmico: espacio entre la membrana plasmática y la membrana externa de las Gram-. En Gram+ se puede observar un espacio similar pero más pequeño entre la membrana plasmática y la pared celular. Este espacio está ocupado por PG muy hidratado, con consistencia gelatinosa, y con abundantes proteínas. Estructura del peptidoglucano (PG): el PG o mureína es un gran polímero compuesto por muchas subunidades idénticas. Está formado por polímeros de azúcares y aa's.
El PG esun heteropolimero que contiene 2 derivados de azúcar: el N-acetilglucosamina (NAG) y el acido N-acetilmuramico (NAM), derivado del NAG. Estos dos compuestos forman el glucano y son el eje del PG que junto con la cadena lateral de aa’s forman el PG.
NAG + ac. Láctico NAM: forma un enlace peptídico en el C3 con el acido láctico.
El grupo COOH del NAM es muy reactivo y puede formar enlaces con aa’s, que en procariotas puden ser del tipo D y L.
El esqueleto de este polímero esta constituido por residuos alternantes de NAG y NAM. Se alternan por enlaces beta 1-> (enlaces glucosidicos muy fuertes). Esta formado por 4 aa: L-alanina, D-glutamico, ac. Meso-diaminopimelico y D-alanina
L-alanina
D-glutamico
Ác. meso -diaminopimélico -> es una mezcla entre D y L, puede variar con la lisina u otro aa. Permite enlaces intracatenarios con otros tetrapeptidos o intercatenarios entre moléculas de PG.
D-ala (tiene un COOH terminal que puede unirse a otra cadena tetrapeptídica por un puente peptídico, o directamente al ácido diaminopimélico de la otra cadena). En presencia de lisocima se rompen los enlaces de los 4 aa.
Las cadenas de subunidades de PG están entrecruzadas por sus péptidos. A menudo, el grupo carboxilo de la D-ala terminal de una mureína está conectado directamente al grupo amino del ácido diaminopimélico de una mureína de otra cadena paralela, pero en otras ocasiones se puede emplear en su lugar un interpuente peptídico.
Hay una gran variedad de PG. Hay más de 100 quimiotipos.
Biosíntesis del PG: es un proceso que consta de 3 fases:
1. - Síntesis de PG propiamente dicha en el citoplasma: las unidades repetitivas del PG se sintetizan unidas a
UDP.
2. - Las unidades se transfieren a un lípido transportador que facilita su transporte a la membrana.
3. - En la cara externa de la membrana se polimerizan, dando lugar a PG mediante una serie de enzimas
presentes en la cara externa de la membrana.
El PG forma una red bidimensional que rodea a las células en forma de saco. Su síntesis requiere que esas unidades se enlacen en 2 dimensiones:
1. Una de ellas enlazando NAG-NAM mediantes enlaces β(1-4).
2. Otra dimensión mediante la unión de una cadena con otra por un enlace peptídico entre el carboxilo del
último aa con el grupo amino de un diaa situado en la posición 3 de la otra cadena. Sin embargo, no siempre sucede esto, y hay cadenas que no van enlazadas.
La composición química del PG es típica de bacterias. En arqueas aparece el pseudoPG. Entre bacterias, el PG se diferencia en la frecuencia de los enlaces y en la composición de las cadenas peptídicas. En el citoplasma, lo primero que ocurre es una fosforilación, produciéndose F-6P o G-6P. Después, se produce una aminación : la fructosa-6P o la glucosa-6P pasan a glucosamina-6P con adición de glutamina. Mediante aporte de CoA se forma N-acetilglucosamina-6P, que pasa a N- acetilglucosamina-1P y finalmente, con gasto de UTP, pasa a UDP -N-acetilglucosamina (UDP-NAG). Ésta reacciona en un proceso de reducción al PEP, formándose UDP-NAM.
A continuación se van incorporando los diferentes aa's. En el citoplasma se sintetiza como un pentapéptido (5 aa's) con 2 alaninas terminales en vez de 1. Así, se forma UDP-NAM-pentapéptido. Éste debe atravesar la membrana, pero ésta es impermeable a moléculas energéticas.
Un lípido, el bactoprenol (solo carga cuando esta desfosforilado), lo transporta por la membrana. El bactoprenol es un lípido isoprenoide de 55C que está fosforilado. Interactúa con el UDP-NAM-pentapéptido , uniéndose al NAM por un enlace fosfodiéster, produciéndose entonces una liberación de UMP al citoplasma. Se liberan fosfatos.
La forma bactoprenol-pentapéptido reacciona con UDP-NAG, y NAG se incorpora. En esta forma se transporta y se libera el bactoprenol. Las cadenas se unen por enlaces peptídicos por las enzimas transaminasas.
A veces la transpeptidación no es directa y se realiza a través de puentes interpeptídicos de pentaglicina.
Las enzimas autolisinas realizan cortes en puntos concretos, y van cortando las uniones que conectan zonas ya existentes de cadena e insertando nuevas unidades, permitiendo así el crecimiento de la célula, hasta que llega un momento en que se tabica.
*la vancomicina evita el crecimiento de las células y la bacitracina evita la desfosforilacion del bactoprenol-
PARED CELULAR
Gram +: es gruesa y homogénea. El PG, es el componente mayoriatario y el esqueleto. También se denomina capa rigida. Constituye entre el 40 y el 90 % del peso seco. Contiene acidos teicoicos (polímeros solubles que contienen glicerol o ribitol (igual que el glicerol, pero con 5C) unidos por grupos fosfato mediante enlaces fosfodiester). La mayor parte de los acidos teicoicos esta asociada al PG mediante enlaces covalentes con el OH en posición 6 del NAM. Cuando están asociados a la membrana se denominan acidos lipoteicoicos, cuya función es de anclaje y contribuir a la carga negativa de la pared, afectando al paso de moléculas cargadas. El C1 del glicerol se une al 3 de otra molecula y el C1 del ribitol se une al 5 de otra, dependiendo del compuesto al que se una. Gram -: es mas compleja que la de gram +. Tiene tres características básicas: esta formada por peptidoglucanos, posee membrana externa y tiene lipoproteínas. El PG es una fina capa rigida que no constituye mas de un 5-10% del peso seco. Esta formada por 1 o 2 capas. La membrana externa es la 2ª bicapa lipídica que recubre el PG. Es la que contiene, proteínas, fosfolípidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas.
En base a su consistencia, las capsulas pueden ser:
-rigidas: gran consistencia.
-flexibles: baja consistencia
