¡Descarga esterilizacion y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
ISSN: 1989-
Metodología de esterilización en el laboratorio microbiológico
Blanca Pérez-Uz. M. Isabel de Silóniz.
Begoña Torralba. Covadonga Vázquez.
Departamento de Microbiología III. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense. C/José Antonio Novais, 2. 28040 Madrid. [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]
Resumen: El trabajo de laboratorio en microbiología requiere siempre ciertos mecanismos de control de las poblaciones microbianas. La esterilización es uno de los mecanismos más utilizados y las técnicas de esterilización aplicables dependen directamente de las características del material de trabajo o de los medios que se vayan a tratar. La esterilización puede ser preparativa, en la que los materiales y medios a utilizar en el laboratorio o durante distintos procesos microbiológicos deben ser esterilizados antes del mismo trabajo. Pero también es necesaria la esterilización antes de desechar el material ya utilizado y contaminado en el laboratorio, en cuyo caso se habla de esterilización final. En este documento se describen las técnicas de esterilización más habitualmente utilizadas en un laboratorio de microbiología general y de metodologías de control de la esterilización.
Palabras clave: Esterilización, Autoclave, tindalización, horno Pasteur, filtración.
INTRODUCCIÓN
La esterilización es un mecanismo por el que se consigue la muerte o eliminación de todos los microorganismos vivos de una muestra, medio, superficie o material de trabajo (LEAHY et al ., 1999). Entre los microorganismos vivos se incluyen bacterias, hongos, protistas, virus y sus formas de resistencia. Un objeto esterilizado está, por lo tanto, totalmente libre de microorganismos incluyendo sus formas de resistencia. No hay que confundir la esterilización con la desinfección en la que no se eliminan todos los microorganismos, sino únicamente aquellos que pueden causar enfermedad o efectos deletéreos sobre los productos en los que se encuentran (en alimentos, cosméticos, etc). Un objeto desinfectado, por lo tanto, no está estéril.
La esterilización se consigue generalmente por métodos físicos y excepcionalmente por la aplicación de compuestos químicos. Entre los métodos físicos más comunes está la aplicación de calor (calor húmedo o calor seco), la filtración o las radiaciones. La esterilización sin embargo también se puede conseguir mediante la aplicación de algunos productos químicos, como el óxido de etileno, formaldehído o
ISSN: 1989-
glutaraldehído. La desinfección se realiza generalmente mediante agentes químicos, que pueden ser desinfectantes o antisépticos dependiendo del uso práctico que tengan. Los últimos deben ser compatibles con los tejidos biológicos, pues se aplicarán en la superficie corporal.
En el laboratorio de Microbiología la esterilización se puede utilizar como esterilización preparativa o como esterilización final. La esterilización preparativa es la que se realiza para mantener libre de microorganismos el material que vamos a utilizar antes de empezar el trabajo en sí mismo o durante el proceso de trabajo (placas Petri, pipetas, medios de cultivo, asas de siembra, hisopos, etc.). La esterilización final sin embargo tiene como único fin destruir los microorganismos con los que se ha estado trabajando. En el primer caso, la elección del proceso de esterilización se debe adecuar para preservar las características de los diversos materiales o medios a esterilizar, pues algunos pueden ser susceptibles de ser destruidos o alterados, durante los mecanismos de esterilización. Sin embargo, en la esterilización final no es necesario considerar ni el tipo de medio de cultivo, ni la posible alteración de materiales, excepto para tener la constancia de que el proceso ha conseguido su finalidad, es decir, la muerte de todos los microorganismos.
METODOLOGÍAS DE ESTERILIZACIÓN PREPARATIVA
La esterilización preparativa o final se puede realizar, como se ha indicado por mecanismos físicos o químicos (Tabla 1). El mecanismo físico más utilizado es el calor, ya sea húmedo o seco (Tabla 1). Sin embargo, cuando estas metodologías físicas no son aplicables, por las características del material o medio a esterilizar, la filtración o la radiación son los mecanismos a elegir. Excepcionalmente y sobre todo en aplicaciones a material de uso sanitario, donde no se pueden utilizar las metodologías ya reseñadas, se utiliza generalmente algún tipo de esterilización fría. La esterilización fría se lleva a cabo en dispositivos cerrados donde se emplea un agente químico gaseoso, como el óxido de etileno, el formaldehído o líquidos como el glutaraldehído.
Agente esterilizante Equipo Calor húmedo Autoclave Calor seco Horno Pasteur Mechero Filtración Filtros membrana Equipos filtración Filtros HEPA Radiación Fuente Rayos gamma Fuente Rayos X Óxido etileno Cámara Glutaraldehído Cámara
Tabla 1. Mecanismos de esterilización.
ISSN: 1989-
Figura 2. Controles de temperatura (A), tiempo (B) y presión (C) en un autoclave actual.
El procedimiento más habitual de esterilización consiste en someter el material a una temperatura de 121ºC (1,1 atmósferas o 15 lb/in^2 o p.s.i.), durante 20 minutos. Sin embargo, estos parámetros se pueden modificar dependiendo de la composición, naturaleza del medio (densidad) o el volumen a esterilizar, etc. El proceso, en cualquier caso, debe garantizar que se alcanza la temperatura adecuada en todo el volumen a esterilizar, por lo que se debe permitir el acceso del vapor de agua, evitando los empaquetados o cerramientos herméticos. Si el volumen a esterilizar es muy grande o la densidad (en caso de líquidos) es elevada, normalmente se debe aumentar el tiempo de exposición o la temperatura (Tabla 2). Generalmente, los cambios de parámetros adecuados a cada medio o material suelen indicarse en las instrucciones del autoclave.
Temperaturas Presiones Tiempos Exposición TºC kPa lb/in^2 (p.s.i.)
Min.
100 0 0 > 116 69 10 60 121 104 15 151 -20^2 132 186 27 3-8^1 /10^2
- Material sin envolver; 2: material envuelto. PSI = 1 atm Tabla 2. Temperaturas y presiones características de esterilización en autoclave.
El autoclave se puede utilizar para la esterilización de medios de cultivo ya sean sólidos (agares) o líquidos, soluciones, material de vidrio, gomas o ciertos tipos de plásticos (policarbonato o polipropileno), acero inoxidable y también material de trabajo como ropas, algodón, gasas, etc. También es un mecanismo que se utiliza para esterilización final de medios de cultivo.
La esterilización con calor húmedo puede causar corrosión de algunos materiales, por lo tanto, no será el método a elegir cuando esto sea un problema. También se debe tener en cuenta que en el proceso de esterilización de medios, puede bajar el pH entre 0,3 y 0,5 unidades, puede caramelizar azúcares y algunos compuestos volátiles se pueden destruir durante el proceso. Los procesos de esterilización largos pueden producir una precipitación de sales.
ISSN: 1989-
Tindalización (calor húmedo)
La tindalización es un método de esterilización fraccionada con calor que se aplica para esterilizar materiales y medios de cultivo termosensibles, que no pueden someterse a temperaturas superiores a los 100ºC. La denominación de este proceso es un homenaje al físico John Tyndall que describió formas bacterianas con una elevada resistencia al calor, diseñando esta metodología para su eliminación. Actualmente el proceso de tindalización se lleva a cabo en autoclave con la válvula abierta de modo que no se produzca sobrepresión y por lo tanto, no se alcanzan temperaturas superiores a las de ebullición (100ºC).
El procedimiento consiste en aplicar tratamientos térmicos de 30 minutos a 100ºC durante tres días consecutivos, dejando el material a temperatura ambiente o a 37ºC en intervalos de 24 horas. Las temperaturas cercanas a los 100ºC destruyen las formas vegetativas pero no las endosporas bacterianas, por eso se requiere la realización de tres periodos de tratamientos consecutivos con el fin de permitir el desarrollo de las formas esporuladas en los intervalos a temperatura ambiente.
Este procedimiento se puede utilizar en medios de cultivo con azúcares, gelatina, sueros o huevo que se descomponen a temperaturas elevadas. También se suele utilizar de forma aplicada en el control de microorganismos en alimentos.
Horno Pasteur (calor seco)
La esterilización puede llevarse a cabo mediante calor seco y en este caso se realiza en una estufa denominada horno Pasteur (Fig. 3), en cuyo interior se disponen los materiales que van a ser esterilizados debidamente protegidos con papel satinado, o en contenedores especiales para evitar la contaminación ambiental una vez finalizado el proceso y hasta su utilización. La destrucción microbiana se produce por oxidación de los componentes celulares y desnaturalización de proteínas. Este es un proceso menos eficaz por la ausencia de agua y por lo tanto deben incrementarse tanto las temperaturas como los tiempos de exposición.
Figura 3. Horno Pasteur.
ISSN: 1989-
Filtración
Las aplicaciones de la esterilización por filtración son diversas en el campo de la microbiología, se puede aplicar para eliminar microorganismos de soluciones, fluidos o gases o para la esterilización del ambiente de trabajo, en todos los casos los microorganismos no son destruidos sino que son retenidos físicamente o adsorbidos por los filtros con un tamaño de poro adecuado. El tamaño de poro que se considera en la actualidad esterilizante es el de 0,22 m aunque más recientemente se tiende a la utilización de poros de 0.1 m (MELTZER y JORNITZ, 2006). Se describen a continuación los tipos de filtros más utilizados y sus aplicaciones más relevantes.
Filtros de membrana. Se utilizan para esterilizar soluciones termolábiles como son antibióticos, vitaminas, medios de cultivo líquidos que contienen azúcares a concentraciones elevadas que pueden caramelizar, o proteínas que pueden desnaturalizarse por el calor, de tal forma que los microorganismos quedan retenidos en el filtro, y el líquido filtrado se encuentra estéril.
Los filtros son de muy variada composición dependiendo de su aplicación, normalmente son de ésteres de celulosa (acetato de celulosa, nitrato de celulosa) politetrafluoretileno (PTFE o teflón), fluoruro de polivinilo hidrofóbico (PVDF), etc. Dependiendo del volumen a esterilizar son de distinto tamaño (diámetro) y se utilizan en distintos mecanismos. Para volúmenes grandes, la solución se pasa a través del filtro montado sobre un soporte y conectado a una bomba de vacío que facilita la succión (Fig. 5). Previamente a la filtración se debe esterilizar todo el equipo que va a estar en contacto con la solución a esterilizar, como el soporte y embudo para filtros y el kitasato que recibirá el medio estéril. Todo este material puede ser de vidrio o de policarbonato o polietileno esterilizables.
Figura 5. Mecanismo de filtración de volúmenes grandes. A. Filtros sin esterilizar. B. Filtros estériles por radiación gamma. C Soporte para filtros. D. Bomba de vacío.
A
B
C
D
ISSN: 1989-
Algunos filtros se venden previamente esterilizados por radiación gamma (ver apartado radiaciones) en carcasas plásticas (Fig. 6 A) o en bolsas herméticas (Fig. 6 B).
Figura 6. Mecanismos de filtración de volúmenes pequeños. Filtros estériles por radiación gamma para utilizar con jeringuilla (A) o con embudo de filtración (B).
Los microorganismos son retenidos en el filtro y por lo tanto el fluido filtrado está estéril. La retención se hace en función del tamaño de poro existiendo filtros de diferente tamaño, los más habituales en microbiología han sido los de 0,45 y los de 0,22 m. Estos filtros retienen la mayoría de los microorganismos pero no virus, ni algunas bacterias pequeñas (micoplasmas), por lo que últimamente se están utilizando de hasta 0,1 m para aumentar el espectro de los microorganismos retenidos (MELTZER y JORNITZ, 2006; GOMEZ y MOLDENHAUER, 2009).
● Filtros de profundidad. Son columnas de materiales fibrosos o porosos (tierra de diatomeas, lana de vidrio, materiales cerámicos porosos) que permiten retener las partículas, en este caso microorganismos y que normalmente se utilizan para la esterilización de gases o como prefiltros para otros filtros esterilizantes. Los filtros de seguridad son importantes para las aplicaciones de bioseguridad. Estas pueden desarrollarse en una cabina de seguridad biológica con flujo de aire que pasa previamente a través de un filtro de profundidad llamado filtro de aire particulado de alta eficacia (HEPA).
Filtros HEPA. Buena parte de las manipulaciones propias de la microbiología deben realizarse en condiciones de esterilidad total para evitar la contaminación de los medios o cultivos y la seguridad de los trabajadores, para ello se usan las cabinas de seguridad biológica con flujo de aire campanas o cámaras de flujo laminar (Fig. 7), se trata de equipos que crean un área de trabajo libre de partículas contaminantes, pasando el aire ambiente a través de filtros y produciendo un flujo laminar sobre la zona de trabajo que provoca una presión positiva constante que previene la infiltración de aire contaminado y se mantiene así la zona en esterilidad.
A B
ISSN: 1989-
Radiaciones
Las radiaciones de distinto tipo se utilizan también en microbiología con la finalidad de la esterilización (LAMBERT y HANSEN, 1998). La más utilizada en el laboratorio de microbiología es la radiación ultravioleta (UV) de una longitud de onda de unos 260 nm. Aunque suele ser poco eficaz debido a su escaso poder de penetración en los materiales, tales como vidrio, agua, películas de suciedad, sin embargo, es muy útil para esterilizar el aire y las superficies, así, se suelen colocar en cabinas de flujo laminar, en habitaciones estériles, quirófanos, etc.
Otras radiaciones, como los rayos gamma, radiaciones electromagnéticas más penetrantes, por su menor longitud de onda (<0,1 nm), suelen ser más efectivas como agentes esterilizantes, pero suelen tener menor uso en el laboratorio microbiológico y sin embargo, un uso industrial muy extendido. Son la opción adecuada para esterilizar equipos o medios sensibles al calor, así se emplean por ejemplo para la esterilización de material plástico de un solo uso o para material quirúrgico desechable, para ciertos alimentos, etc.
Esterilizantes gaseosos
Dentro de este apartado incluimos todos aquellos compuestos químicos que se suelen utilizar como esterilizantes, y que se suelen utilizar en fase gaseosa generalmente. Entre estos compuestos ya hemos mencionado el óxido de etileno o el formaldehído. Estos suelen utilizarse para esterilizar materiales sensibles al calor o que no pueden someterse a radiaciones. Sus aplicaciones suelen darse en la industria farmacéutica o en medicina. El compuesto más utilizado es el óxido de etileno, que actúa por medio de su actividad alquilante sobre los hidrógenos lábiles en ácidos nucléicos y otras macromoléculas, inactivándolas. El proceso de esterilización en estos casos suele darse en cámaras herméticas y suele requerir en general tiempos de exposición largos (30 minutos - 18 horas). Aunque procesos a temperaturas entre 60- 80ºC pueden disminuir el tiempo de exposición (30 min-6 h) (BLOCK, 2001). Suele ser poco usado en el trabajo rutinario del laboratorio microbiológico.
METODOLOGÍAS DE ESTERILIZACIÓN FINAL
Su finalidad es destruir los microorganismos con los que se ha trabajado y descontaminar el material utilizado antes de que sea desechado. Generalmente se hace por calor húmedo en autoclave, o por incineración.
Cuando se utiliza el calor húmedo en autoclave, por ejemplo a 121ºC, durante 20 minutos; la temperatura y tiempo de elección son irrelevantes, siempre que sean esterilizantes, ya que las precauciones para evitar la alteración de medios de cultivo y materiales en este caso, ya no tienen importancia. El material contaminado (placas, tubos, medios, etc) se suele introducir en bolsas especiales para su utilización en
ISSN: 1989-
autoclave (Fig. 8), que se colocan en contenedores apropiados para las condiciones usadas en el autoclave.
Figura 8. Bolsas autoclavables para esterilización y bolsa conteniendo material para eliminar ya esterilizado, en un contenedor apropiado.
Incineración (calor seco)
La esterilización de cierto tipo de material por incineración, se realiza en aquel material contaminado de desecho antes de ser eliminado. Este procedimiento es característico en la eliminación de material sanitario desechable contaminado. En este caso, se suelen utilizar contenedores apropiados de un solo uso (Fig. 9) que tienen cierre hermético una vez llenos. En estos se recolecta el material contaminado (puntas, agujas, gasas, etc) y serán posteriormente incinerados con su contenido.
Figura 9. Contenedores de diversos tamaños para la eliminación de material contaminado para incineración.
ISSN: 1989-
esterilización, por ejemplo, algunas especies del género Bacillus ( Bacillus stearothermophilus , B. subtilis var. Níger, B. pumilus ) son utilizadas comúnmente como organismos de validación de esterilización en los autoclaves de vapor.
ESTANDARES DE ESTERILIZACIÓN
La validación de calidad en los procesos de esterilización, sigue una normativa publicada y consensuada en las normas ISO (International Organization for Standardization) que está específicamente creada para productos utilizados en salud, y material médico, aunque realmente muchos de ellos sirven para cualquier proceso de esterilización. En los últimos años, los estandares de esterilización europeos (EN 550, EN 552 y EN 554), fueron revisados para convertirse en estandares ISO. Previamente las normas ISO relacionadas con estas (ISO 11135, ISO 11137 e ISO 11134 respectivamente) también fueron reemplazados (ver recursos electrónicos: Global Sterilization: Making the Standards Standard y Changes in sterilization standards). Estas normas se han ido publicando sucesivamente en varios años en nuevos documentos que se detallan a continuación (Tabla 4). Los nuevos estandares siguen un formato común, proporcionando definiciones consistentes y utilizando un sistema de calidad común.
En estas normativas se detallan los procesos y mecanismos adecuados y consensuados de calidad en la utilización de esterilización, y que son requeridos a todos aquellos laboratorios de microbiología que pretendan obtener una certificación de calidad.
Norma Protocolo Esterilizacióna Publicaciones ISO 17665-1:2006 Calor (Húmedo) ISO/TS 17665-2:2009 Calor (Húmedo) ISO 25424:2009 Esterilización temperatura y formaldehído.^ con^ vapor^ a^ baja
ISO 11137:2006 Radiación
Parte 1 Parte 2 Parte 3 ISO 11135:2007 Óxido de etileno Parte 1 Parte 2 ISO/TS 11135-2:2008 Óxido de etileno ISO 14161:2009 Indicadores Biológicos
ISO 11138:2006 Indicadores Biológicos
Parte 1 Parte 2 Parte 3 Parte 4 Parte 5
Tabla 4. Normas ISO sobre esterilización (Sterilization of health care products or medical devices) y control de esterilización.
ISSN: 1989-
BIBLIOGRAFÍA
Block, S.S. 2001. Disinfection, sterilization and preservation. 5 th^ Ed. Lippincott Williams y Wilkins Eds. Philadephia.
Chamberland, C. 1884. Sur un filtre donnant de l’eau physiologiquement pure. Compt. Rend. Acad. d. sc. Paris. XCIX: 247.
Gomez, M. y Moldenhauer, J. 2009. Biological indicators for sterilization processes. PDA Books. Davis Healthcare International Publishing, LLC. Bethesda.
Lambert B.J. y Hansen J.M. 1998. ISO radiation sterilization standards. Radiation Physics and Chemistry , 52 (1): 11-14. http://www.ingentaconnect.com/content/els/0969806x/1998/00000052/ 001/art
Leahy, T.J.; Kerry, L.R. y Christopher, M.R. 1999. Microbiology of sterilization processes. En: Validation of pharmaceutical processes: sterile product. Carleton, F.J. y Agalloco, J.P. Ed. Pp: 353-380.
Lewis, R.E. 2002. Practical guide to autoclave validation. Pharmaceutical Engineering. ISPE 2002. http://www.idc-ch2m.com/Papers/IDC2002%20autoclave.pdf
Meltzer T.H. y Jornitz, M.W. 2006. Chapter 1. The sterilizing filter. En: Pharmaceutical Filtration: The Management of Organism Removal. PDA Books. Pp. 4-21.
RECURSOS ELECTRÓNICOS
Alfa Medical Equipment. (15-07-09). Autoclave temperature and time tressure thart. http://www.sterilizers.com/autoclave-time-temperature-pressure-chart.html
Global Sterilization: Making the standards Standard. Medical device & diagnostic industry, Marzo, 2005. http://www.devicelink.com/mddi/archive/05/03/008.html
Changes in sterilization standards. 2007. http://www.bsiamerica.com/en-us/Sectors-and-Services/Industry- sectors/Healthcare-and-medical-devices/eUpdates/2007/Changes-in- sterilization-standards/
Recibido: 17 marzo 2010. Aceptado: 30 marzo 2010.
