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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
manual de prácticas
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
María de los Angeles Aquiahuatl Ramos
María de Lourdes Pérez Chabela
Casa abierta al tiempo (^) UNIDAD IZTAPALAPA
Rector General Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva Secretario General Dr. Ricardo Solís Rosales
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector Dr. José Lema Labadie Secretario Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
División de Ciencias Biológicas y de la Salud Director Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda Secretario Académico M. en C. Arturo L. Preciado López
Departamento de Biotecnología jefe del Departamento Dr. J. Mariano García Garibay
ISBN 970-31-0141-
Primera Edición: 2004 Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina. Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F.
Impreso y hecho en México
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de los Angeles Aquiahuatl Ramos
María de Lourdes Pérez Chabela
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
índice
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PRESENTACIÓN
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
PRÁCTICA # 1
Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
Esterilización de materiales y medios de cultivo
Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
Prueba de esterilidad de materiales
PRÁCTICA # 2
Preparación, fijación y coloración simple de frotis
Preparación de frotis
Fijación del frotis
Tinción simple
Observación al microscopio
PRÁCTICA # 3
Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas
Tinción diferencial de Gram
Tinción selectiva de endosporas
Tinción negativa para observación de cápsulas
Observaciones al microscopio
PRÁCTICA # 4
Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias
Técnica de estría cruzada
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
Condiciones de incubación
PRÁCTICA # 5
Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos
Siembra de hongos
Descripción macroscópica de levaduras y mohos
Descripción microscópica de levaduras
Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
PRÁCTICA # 6
Pruebas de diferenciación bioquímica
Técnica de Inoculación en cajas de Petri
Técnicas de Inoculación en tubos
Evaluación de actividades metabólicas
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PRÁCTICA # 7
Métodos de cuantificación de microorganismos Técnica turbidimétrica Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer Técnica de dilución y siembra en placa
PRÁCTICA # 8 Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano Efecto de la Temperatura Efecto del pH
PRÁCTICA # 9 Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias Efecto de la desecación
PRÁCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano Inoculación e incubación del cultivo Tratamiento de las muestras
BIBLIOGRAFÍA GENERAL
Anexo 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105 Anexo 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
115 Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu-
ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de Los Angeles Aqulahuatl
Dra. Ma. de Lourdes Pérez Chabela
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RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!*
Reglas de laboratorio
- Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse antes de abandonar el laboratorio.
- No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios o cultivos microbianos.
- Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
- Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
- Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves periodos.
- Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de aerosoles.
- No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
- Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfec- tante que se le proporcionará para este fin.
- Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de sus cuadernos o prendas de vestir.
- Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami- nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará el profesor.
- Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas, autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
- En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas
manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**
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Preparación y esterilización de materiales
y medios de cultivo
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a 1 potenciómetro
1 horno de calor seco
Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10 mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitación
1 autoclave
1 mechero Fisher
1 incubadora a 35°C
1 hisopo estéril, algodón y gasa
papel manila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en la
desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios
para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudian-
te aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-
res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún
otro medio.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocará un capuchón de papel.
4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un
potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH
0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo
con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.
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- Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se esteriliza en el autoclave.
- Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto; cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
- Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
Esterilización de materiales y medios de cultivo
- Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.
- Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo a las siguientes instrucciones: a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua destilada. b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia- les en la canasta del autoclave y colocarla dentro. c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar a que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad. d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121 °C o 15 Ibs de presión revisando continuamente la escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse el nivel de calentamiento mo- viendo la perilla de control al nivel medio o bajo. e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0". Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente la puerta, de adelante hacia atrás para evitar quemaduras por la salida del vapor.
Preparación de las cajas de Petri y tubos con medios de cultivo
- Los tubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
- Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor excesivo.
- Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
- Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado- samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.
- Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.
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manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L
Cuadro 1
Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDIO
DE CULTIVO
AGAR
NUTRITIVO
M Í N I M O
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Abierta al aire Abierta en área
aséptica
Control
a
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Cuestionario
¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales se aplica cada uno?
- Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
17 manual de prácticas del
