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TEMA 6. CRECIMIENTO MICROBIANO
Crecimiento de poblaciones microbianas: incremento de biomasa y número de individuos. Medida del crecimiento. Parámetros básicos: tasa específica de crecimiento y tiempo de generación; relación entre ambos. 1.- Crecimiento de una población microbiana en ambiente cerrado (“batch culture”): curva de crecimiento y sus fases: lag, exponencial o logarítmica, estacionaria y de muerte. Carga máxima (Nmax). Propiedades de las células en las diferentes fases. 2.- Efecto sobre el crecimiento de la concentración de nutrientes: Influencia sobre la tasa de crecimiento; concepto de Ks. Influencia sobre la carga máxima y concepto de rendimiento: Y. 3.- Cultivo contínuo: funcionamiento y parámetros básicos del quimiostato. El estado de equilibrio. Aplicaciones.
1.- Crecimiento de una población microbiana en ambiente cerrado (“batch culture”): curva de crecimiento y sus fases: lag, exponencial o logarítmica, estacionaria y de muerte. Carga máxima (Nmax). Propiedades de las células en las diferentes fases.
El crecimiento de un microorganismo se define como el aumento de sus componentes
celulares, que puede tener como resultado un incremento de su tamaño o del número de individuos de una población, o de ambos.
En este primer caso, analizaremos el crecimiento de una población en un ambiente cerrado, “bach culture” (modelo teórico). En ella, se produce un crecimiento exponencial de la
biomasa o del número de células (dos aproximaciones sobre el crecimiento microbiano). En algunos casos, como el crecimiento micelial, solo se puede calcular este crecimiento como
incremento en la biomasa (cantidad de materia viva). De esta manera, definimos la tasa específica de crecimiento (μ) como:
Sin embargo, las predicciones de los modelos teóricos no se ajustan a los resultados obtenidos experimentalmente (no se observa la recta predicha), sino que encontraremos una
representación totalmente distinta, mucho más compleja y con diferentes fases durante la vida del microorganismo. La única fase que se ajusta a la descrita en los modelos teóricos es la fase
exponencial.
Así, podemos obtener la tasa de crecimiento como pendiente de la recta.
g: tiempo de generación. Tiempo que tarda una célula en dividirse en otra. Al ↑g→↓μ.
t/g: número de generaciones producidas.
Este tiempo de generación es, por lo general, más corto en procariotas que en eucariotas, aunque existen casos de procariotas con tiempos de generación muy largos (gran variabilidad de comportamientos).
Fase de latencia : no hay crecimiento (e incluso a veces se observa una bajada). Esta fase representa el periodo de adaptación del inoculo (porción de microorganismo) a las condiciones del medio en el que estamos realizando el experimento (pH, temperatura, nutrientes,…).
Las razones por las que se requiere esta fase de latencia son diversas: las células pueden ser viejas y poseer cantidades reducidas de ATP, cofactores esenciales o ribosomas estas sustancias
deben sintetizarse antes de que se inicie el crecimiento; el medio puede ser diferente al óptimo de crecimiento de los microorganismos necesitará nuevas enzimas para poder usar los nuevos
nutrientes; que los microorganismos se hayan alterado y necesiten un tiempo de recuperación. Cuanto más distintas sean estas condiciones a las óptimas de los microorganismos, más larga es
esta fase.
Cualquiera que sea el motivo, durante la fase de latencia las células se equipan de nuevo,
replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por último, se dividen. Por lo tanto, para que este tiempo de latencia sea pequeño, las nuevas condiciones deben parecerse a las del medio donde
estaba el inoculo inicialmente.
Fase exponencial : esta es la fase que se ajusta al modelo teórico que habíamos descrito anteriormente. Una vez se ha producido la adaptación al medio, da comienzo la fase exponencial, en la que el cultivo comienza a crecer hasta alcanzar una μ máxima y una g mínima.
Los microorganismos crecen y se dividen hasta alcanzar el nivel máximo posible, en función de su potencial genético, del tipo de medio y de las condiciones en las que crecen. Durante esta fase, la
velocidad de crecimiento es constante, es decir, los microorganismos se duplican en número a intervalos regulares. No existe sincronización, cada célula se divide y aumenta de tamaño en un
momento ligeramente diferente del resto, por ello, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar saltos discretos. En esta fase, la población es mucha más uniforme, tanto química
como fisiológicamente. Por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos. Además, durante esta fase las células son más sensibles a
condiciones ambientales adversas (se rompen con más facilidad).
μ = μmax ([S] / Ks + [S])
de nutriente. Por ejemplo, un =0.3 la cepa convierte 0.3 g de un gramo de glucosa en
biomasa. Si tenemos otro = 0.5, esta cepa será más eficiente ya que transforma más cantidad de glucosa por gramo. La determinación del valor de Y depende para que queramos el
microorganismo.
Y bajos medios de cultivo (crecimiento óptimo de microorganismos). Y altos limpiar medios contaminados como aguas residuales donde lo que queremos es que metabolice la mayor cantidad de sustrato que pueda convertir.
Nota: la gráfica representada no sería del todo correcta ya que, en general, se produce una caída, al principio que hace que llegue a Y=0 antes de que se llegue a una concentración de nutrientes=0.
Esto se debe a que los microorganismos requieren de una concentración umbral de nutrientes para que comience su crecimiento, cuya energía se destina a tareas de mantenimiento de los
componentes celulares y a la realización de otras funciones esenciales para las células (mantenimiento del pH, movilidad flagelar,…). A esta cantidad se le denomina energía de
mantenimiento.
Otra relación importante es la que se produce entre la concentración de nutrientes disponibles y la velocidad de crecimiento del microorganismo (tasa de crecimiento, μ). Presenta una cinética similar a la de muchas enzimas, con una curva asintótica, donde a concentraciones pequeñas de nutriente se observa un crecimiento lineal y a concentraciones mayores se alcanza su velocidad máxima.
,donde Ks = concentración de nutriente (sustrato) a la cual se alcanza la mitad de la tasa de crecimiento máxima. Además, se tarta de una medida de la afinidad del microorganismo con el nutriente.
↓ Ks ↑ afinidad del microorganismo al sustrato. ↑ Ks ↓ afinidad del microorganismo al sustrato.
3.- Cultivo contínuo: funcionamiento y parámetros básicos del quimiostato. El estado de equilibrio. Aplicaciones.
Hasta ahora hemos tratado los SISTEMAS CERRADOS , denominados cultivos discontinuos,
en los que no se renuevan los aportes de nutrientes ni se eliminan los residuos. El crecimiento exponencial dura solamente unas pocas generaciones y el cultivo alcanza pronto la fase
estacionaria. Sin embargo, es posible cultivar microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantengan constantes las condiciones ambientales gracias a un suministro continuo de nutrientes
y la retirada de los residuos. Estas condiciones se cumplen en un laboratorio mediante los SISTEMAS CONTINUOS (que se aproximan más a lo que ocurre en medios naturales). En este tipo
de cultivos, se puede mantener una población microbiana en fase de crecimiento exponencial y a una concentración constante de biomasa durante un largo período de tiempo.
Para ello, en procesos industriales, se suelen emplear aparatos como el quimiostato o fermentador. Esta maquinaria consta de un medio fresco que contiene los nutrientes, un fresco de
cultivo donde se lleva a cabo el crecimiento microbiano y un colector o receptáculo. En los sistemas continuos, podemos controlar varios parámetros:
Sr: [S] en el reservorio (medio fresco) F: velocidad de entrada/salida del medio fresco al reservorio, V: volumen D: tasa de dilución (F/V). Velocidad a la que se renueva el contenido total del recipiente de cultivo. Se mide en.
El parámetro más importante es D que, junto a la Sr, nos permiten controlar de manera precisa la dinámica de crecimiento de
los microorganismos en un recipiente de cultivo.
Gráfica. Relación de la tasa de dilución y la concentración de
nutrientes, el tiempo de generación y la densidad celular en sistemas continuos.
Como vemos, para un amplio rango de D, la densidad de la población microbiana
permanece inalterada y es constante. Además, la concentración celular microbiana y el tiempo de generación están relacionados con la tasa de dilución (D).
Al aumentar D, el tiempo de generación disminuye la velocidad de crecimiento aumenta. El nutriente limitante quedará casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio. De
esta manera, el estado de equilibrio nos proporciona una gran cantidad de información, no solo de los distintos parámetros (cuadro arriba) sino que nos permite hacer comparaciones entre distintas
cepas.
Sin embargo, existen casos en los que es difícil establecer un equilibrio. Si la tasa de
dilución es alta , es decir, aumenta con demasiada rapidez, los microorganismos pueden desaparecer del recipiente de cultivo antes de que se multipliquen, porque la tasa de dilución es
superior a su velocidad máxima de crecimiento (no pueden crecer a tal velocidad). Por tanto, si D>μmax, no se podrá compensar el rebosamiento y, por tanto, no se podrá alcanzar el equilibrio. La
Estado de equilibrio : cuando se alcanza este estado, la densidad celular es constante en el recipiente de cultivo mientras no se cambie la tasa de dilución (nº de células cte). Así, podemos determinar los diferentes parámetros del medio de cultivo a distintas D. El cultivo crecerá con una velocidad constante e igual al valor de D. APLICACIONES cambiar D y esperar que se recupere el equilibrio.
1.1. Influencia de la temperatura: factores que determinan los máximos y mínimos de temperatura de crecimiento de los microorganismos. Termotolerancia y termofilia. Ambientes de temperatura extrema.
La temperatura es un parámetro que afecta tanto a los microorganismos como al resto de seres vivos. De hecho, los microorganismos son especialmente susceptibles porque son, generalmente, unicelulares y su temperatura varía con la ambiental. Por estas razones, la temperatura de la célula microbiana refleja directamente la de su ambiente.
Al aumentar la temperatura, se produce un aumenta de la velocidad de las reacciones químicas (termosensibilidad de las enzimas). Si esta T supera la Tóptima puede también provocar la desnaturalización de muchas moléculas biológicas. Para evitar esto, los microorganismos presentan varios mecanismos (proteínas de choque térmico chaperonas) que intentan disminuir este efecto pero que, en algunas situaciones, acaban provocando su lisis térmica. En condiciones por debajo de la temperatura óptima, un aumento en la temperatura eleva la velocidad de crecimiento, porque la velocidad de una reacción catalizada por enzimas, como la de cualquier reacción química, casi se duplica por cada aumento de temperatura de 10°C. Como la velocidad de cada reacción aumenta, el metabolismo es más activo y el microorganismo crece más rápidamente. Podríamos pensar que la Tmín sería aquella a la que el agua se congelaría, ya que sin un medio líquido las reacciones no se pueden llevar a cabo. Sin embargo, la mayoría de los micro dejan de crecer a T superiores a la de congelación del agua. En estos casos, la Tmín viene determinada por la fluidez de la membrana ya que es aquí donde se producen la gran mayoría de las reacciones químicas.
A partir de cierto punto (temperatura óptima), un mayor aumento de la T disminuye la velocidad de crecimiento, por lo que, temperaturas muy altas, podrían llegar a ser letales. Las altas temperaturas ocasionan daños a los microorganismos al desnaturalizar las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras proteínas. El calor también deteriora las membranas microbianas; la doble capa lipídica puede fundirse y desintegrarse. Por ello, a pesar de que las enzimas funcionales actúan más rápidamente a temperaturas elevadas, el microorganismo puede alterarse hasta el punto de inhibirse su crecimiento, porque el daño no puede repararse. A muy bajas temperaturas, las membranas se gelifican y las enzimas operan a baja velocidad provocando una marcada disminución del crecimiento.
En definitiva, cuando los microorganismos están por encima de la temperatura óptima, tanto su estructura como su función se ven afectadas por lo que se pierde su viabilidad. Si las temperaturas son menores que la Tóptima, no necesariamente conduce a su muerte ya que, aunque su función se ve afectada, puede mantener su estructura y su composición química. Por ello, en algunos experimentos se suelen congelar con crioproctetores (métodos de conservación).
Existen diversos tipos de microorganismos según el rango de temperaturas a las que crecen de forma óptima: Termófilos : crecen a temperaturas>45ºC (lo más normal es que oscilen entre 55 y 65 ºC). Un caso especial son los hipertermófilos , que tienen un óptimo de crecimiento por encima de 80ºC). Mesófilos , crecen a temperaturas de entre 20ºC y 45ºC. Un caso especial son los psicotrofos cuando también son capaces de crecer a temperaturas de refrigeración (5-7ºC) pero más lentamente Psicrófilos , crecen a temperaturas < 20ºC. En ellos, como vemos su tasa de crecimiento es mucho menor.
Los hipertermófilos suelen vivir en medios como chimeneas submarinas, aguas muy cálidas o lugares con actividad geotérmica. Dentro de este grupo, encontramos un gran número de arqueas capaces de vivir a temperaturas de unos 130ºC. Este tiene una gran aplicación sobre el estudio de enzimas capaces de actuar a estas temperaturas (taq-polimerasa).
Si los valores máximo y mínimo están cercanos entre sí, decimos que son estrictos, no pueden crecer a temperaturas lejanas al óptimo. Si, al contrario, el rango de temperaturas es muy amplio, decimos que son facultativos.
1.2. Influencia de la disponibilidad de agua. Actividad de agua (Aw) y factores que la afectan. Solutos compatibles. Osmófilos, xerófilos y halófilos. Tipos de halófilos. Halotolerantes. Ambientes de alta salinidad.
En este caso, el parámetro que mide la disponibilidad de agua es la Aw (actividad del agua). Su valor oscila entre 0 y 1 y se obtiene tras comparar la humedad relativa de una muestra respecto del agua pura, cuyo valor se corresponde con Aw=1.
En esta tabla se muestran algunos ejemplos de la actividad de agua de los distintos microorganismos en diversos ambientes. La línea discontinua muestra el límite de capacidad de crecimiento que presentan las bacterias y arqueas (Aw=0.75), que necesitan de mayor concentración de agua pura para poder crecer. A estos valores tan bajos de actividad de agua solo son capaces de crecer eucariotas como hongos y algas.
Para contrarrestar la falta o robo de agua, los microorganismos acumulan en el interior de sus células solutos compatibles , compatibles con el funcionamiento normal de la célula. La estrategia que llevan a cabo consiste en aumentar la concentración de solutos en el interior para permitir la entrada de agua del medio externo. Existen de diversos tipos:
Del tipo aminoácido: aa prolina, glutamato, glicina betaina, ectoina. (los más comunes)
1.3. Influencia del pH: acidófilos y alcalófilos. Mantenimiento del pH intracelular. Ambientes de pH extremo.
En general, los microorganismos crecen y proliferan de forma óptima a pHs neutros, aunque existen algunos casos de microorganismos que crecen a pHs extremos (tanto ácidos como básicos):
Acidófilos : microorganismos que viven a pHs bajos, donde las condiciones del medio son muy ácidas. Un ejemplo de ello son algunas arqueas del género ferroplasma o picrophilus. Basófilos o alcalófilos : microorganismos que viven a pHs altos (básicos). Un ejemplo de ellos son algunas bacterias como Microcystis aeruginosa o Bacillus alcalophilus.
1.4. Influencia del oxígeno. Funciones y toxicidad del O2; enzimas protectores y su distribución. Tipos de microorganismos según sus relaciones con el O2: aerobios estrictos y microaerófilos; anaerobios facultativos; anaerobios aerotolerantes y estrictos. Técnicas de cultivo de anaerobios.
Como sabemos, el oxígeno es una de las moléculas más importantes para la vida ya que es esencial para la respiración de los aerobios y puede actuar como aceptor de e-. Sin embargo, en algunos microorganismos puede resultar tóxico o, incluso, considerarse como un veneno en algunos de ellos. Su toxicidad deriva de sus radicales altamente oxidantes capaces de oxidar diversos componentes celulares.
Para evitar la formación de radicales oxidantes , los microorganismos presentan enzimas protectoras que degradan estos componentes tóxicos transformándolos en otras especies menos reactivas hasta llegar al agua. Un organismo será más o menos tolerante al oxígeno dependiendo de la cantidad de estas enzimas de la que disponga. (↑ nº de enzimas↑ tolerancia al O2). Entre estas enzimas podemos destacar la catalasa que detoxifica el agua oxigenada y la superoxido dismutasa que, en muchos casos se suele combinar con la catalasa, para eliminar una mayor cantidad de estos radicales. Por tanto, lo que se debe buscar es un equilibrio en la concentración de oxígeno.
Radicales oxidantes
3 tipos básicos de comportamiento de los microorganismos en presencia de O2: Aerobios (requieren O2 para crecer). Tipos: o Aerobios estrictos : necesitan la presencia de oxígeno obligatoriamente, tienen la dotación completa de enzimas protectoras para evitar sus efectos tóxicos. (a) Proliferan en aquellas zonas en las que existe O2. o Microaerófilos : son respiradores obligados de oxígeno pero mantienen niveles bajos de enzimas protectoras, no suficientes para proliferar a la concentración de O2 atmosférica. (d) En este caso, crecen en las zonas superficiales con O2 aunque alcanza su óptimo un poco por debajo de esta zona.
Facultativos : pueden crecer en ausencia o presencia de oxígeno. En presencia de este compuesto realizan una respiración aerobia (modo preferente, pues es la forma de respiración más rentable energéticamente) y en ausencia realizan la fermentación o respiración anaerobia. Presentan enzimas protectoras (c) Estos micro crecen a lo largo de todo el tubo aunque su densidad es mayor en zonas que presentan O2.
Anaerobios : no utilizan el oxígeno en su metabolismo y crecen en medios en ausencia de O2. En estos casos, su presencia puede llegar a ser tóxica y detener su proliferación. o Estrictos : no presentan enzimas protectoras por lo que mueren en medios con oxígeno. (b) Crecen en su mayoría, lo más alejado posible del medio con O2. o Aerotolerantes : tienen enzimas protectoras y a pesar de no utilizar O2 para llevar a cabo su metabolismo lo tolera muy bien gracias a la presencia de estas enzimas. (e) Crece a lo largo del tubo de manera indistinta.
Cuando se trabaja con micro anaerobios se deben realizar los experimentos en ambientes sin O2 lo que dificulta y empeora su estudio, debido tanto a la manipulación como al mantenimiento de dichas condiciones.
1.5. Influencia de otros factores físico-químicos: presión hidrostática. Barófilos y barotolerantes. Radiaciones: ambientes de alta radiación luminosa. Efecto
Esterilización: es el proceso por el cual todas las células vivas, esporas viables, virus y viroides son destruidos o eliminados de un objeto o hábitat. Un objeto esterilizado está totalmente libre de microorganismos viables, esporas y otros agentes infecciosos (todos). Desinfección: destrucción, inhibición o eliminación de, al menos, los microorganismos que pueden causar enfermedad (elimina células vegetativas pero no micro resistentes como endosporas). El principal objetivo es destruir patógenos potenciales, aunque la desinfección también reduce significativamente la población microbiana total. Los desinfectantes son agentes, normalmente químicos, empleados para desinfectar. Un desinfectante no esteriliza necesariamente un objeto porque pueden permanecer esporas y algunos microorganismos viables de elevada resistencia. Antisepsis: prevención de una infección o sepsis, y se realiza con antisépticos. Son agentes químicos que se aplican sobre los tejidos para prevenir una infección, destruyendo o inhibiendo el crecimiento de agentes patógenos. También reducen la carga microbiana en general. No deben dañar demasiado el tejido del huésped por lo que los antisépticos no son tan tóxicos como los desinfectantes (destruir e inhibir formas vegetativas y que sea lo suficientemente inocuo para nuestras células). Quimioterapia: utilización de algún agente químico para controlar infecciones producidas por microorganismos en los seres humanos.
Métodos de control bacteriano
Agentes físicos: calor y radiación Agentes químicos: de tipo gas o líquido Agentes mecánicos: filtración esterilizante Agentes biológicos: que unos organismos destruyan a otros. no entraremos en ella
Los agentes antimicrobianos se pueden clasificar según el tipo de microorganismo sobre el que actúan y según el modo de acción (existe un gran variabilidad química). De esta forma, un agente antimicrobiano que actúa sobre bacterias (hongos) puede ser de tres tipos:
Bacteriostático (fungiostático) ; inhibe el crecimiento de las bacterias pero no las mata. Bactericida (fungicida) ; mata a las bacterias sin la necesidad de destruirlas o lisarlas y el nº de células viables desciende de forma logarítmica. Bacteriolítico (fungiolítico) ; mata a las bacterias por lisis de manera directa. En este caso, tanto el nº de células totales como las viables desciende.
Verde: nº de células viables
Rojo: nº de células totales
3. Control microbiano mediante agentes físicos y químicos. Esterilización. Cinética de muerte, parámetros D y Z.
El método más común de esterilizar el material del laboratorio es la aplicación de calor (agente antimicrobiano físico): el tratamiento térmico es capaz de destruir a los microorganismos cuando estos se exponen a temperaturas altas como de 120ºC (temperatura que se aplica en autoclaves para producir la esterilización). De esta manera, lo que se produce es una disminución exponencial de la población bacteriana.
Uno de los parámetros fundamentales que nos informan dela desaparición de los microorganismos es el valor D que se define como el tiempo (en minutos) necesario para reducir al 90% el número de microorganismos presentes inicialmente (o reducir un orden logarítmico ).
Otro parámetro de gran importancia es el valor Z que se define como la variación de temperatura que debemos utilizar para hacer que el valor D disminuya un orden logarítmico ( veces). Estos dos parámetros nos indican como como debemos actuar ante nuestro microorganismo (como eliminarlo).
