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MICROBIOLOGÍA

II

Apuntes

Curso 05/

Carla Iglesias Rodríguez

A) DIVERSIDAD MICROBIANA Y BIOTECNOLOGÍA TEMA 1 : Principios de Taxonomía Bacteriana

1. Conceptos:

• TAXONOMÍA: Ciencia que estudia la clasificación, identificación y nomenclatura de los microorganismos. No hay que confundirla con la Filogenia.

IDENTIFICACIÓN:

Procedimiento para la caracterización de un determinado organismo NOMENCLATURA: Asignación de nombres siguiendo las normas del ICSB. Para nombrar una especie se le asignan a ésta 2 nombres: 1º_ Se refiere al Género al cual pertenece, el cual normalmente se abrevia con una letra mayúscula, correspondiente a la primera letra del nombre del género. 2º_ Se refiere a la Especie, es el nombre específico, el cual no se abrevia.

3. Sistemas de clasificación según sus:

• Características morfológicas, metabólicas y ecológicas.
• Clasificación Fenética: En función de las semejanzas fenotípicas la cual, para que sea más riguroso, más científica, ha dado lugar a:
• La taxonomía numérica. (explicado en problemas) La semejanza entre organismos se determina mediante cálculos numéricos, coeficientes de similitud. Permite analizar muchos caracteres de una manera numérica. Esto da lugar a muchos problemas ya que la semejanza no implica igualdad. Recordemos que el ambiente es un factor muy importante en el caso de los microorganismos. Por tanto se tiende a hacer una:
• Clasificación filogenética que es en función de las relaciones evolutivas. En el caso de las bacterias es más difícil ya que no presenta registro fósil pero se puede hacer comparando secuencias genéticas.

4. Características utilizadas en taxonomía: ****CARACTERÍSTICAS CLÁSICAS:**

• Morfológicas: Bacilos, cocos, filamentosas, curineforme (indeterminada), espiroquetas...
• Fisiológicas y metabólicas: Fotótrofo, Organótrofo, Litótrofo...
• Ecológicas: Termófilos, Acidófilos, halófilos...
• Movilidad: Flageladas, bacterias deslizantes, helicoidales...
• Presencia de pigmentos
• (^) Sensibilidad a sustancias

****CARACTERÍSTICAS MOLECULARES:**

• Contenido en G+C: (G+C) / (A+G+C+T) x 100 Los límites de relaciones de GC para los procariotas es mayor que para ningún otro reino de organismos. La composición de bases de los DNA se ha determinado para una amplia variedad de bacterias y se han podido observar diversas correlaciones: 1º_ Los organismos con fenotipos muy semejantes suelen tener, pero no siempre, relaciones de bases de DNA semejantes. 2º_ Si se considera que dos organismos están relacionados estrechamente por criterios fenotípicos se encuentra que tienen relaciones de bases completamente diferentes. Un examen más de cerca suele indicar que estos organismos no están relacionados tan estrechamente como se suponía. 3º_ Dos organismos pueden tener relaciones de bases idénticas y sin embargo pueden no estar relacionados ni taxonómica ni filogenéticamente, ya que es posible una variedad de secuencias con DNA de una composición determinada de bases.

En realidad, la relación de GC es un determinante evolutivo más que de apoyo porque dos organismos con relaciones GC similares pueden no tener secuencias similares en el DNA.

grandes distancias evolutivas para actuar como herramientas filogenéticas para discernir profundas interrelaciones evolutivas.

La naturaleza del rRNA permite comparaciones de DNA : rRNA con la secuenciación de rRNA han demostrado que las técnicas dan información filogenética semejantes a los niveles de especie, género y, aún, de familia.

• Análisis de Ácidos Grasos:

1. Caracterización de los tipos y proporciones de ácidos grasos presentes en los lípidos de la membrana citoplasmática y la membrana externa de la pared celular (Gram -). Dichas membranas presentan diferentes patrones específicos para cada especie. (Ejm, el género Mycobacterium presenta más lípidos que el resto de bacterias)
2. Los Ácidos Grasos se modifican para formar sus correspondientes metilésteres. Estos derivados volátiles son identificados por cromatografía de gases.
3. Concepto de especie bacteriana: Hablar de Especie Bacteriana es difícil cuando se habla de bacterias (no hay reproducción sexual) por lo que se utilizan tanto características fenotípicas como genéticas.

La base de la genética viene dada por la secuenciación del rRNA y también por hibridación genómica. Hemos de utilizar estas bases genómicas porque la fisionomía y la filogenia no están necesariamente relacionadas. (en la transparencia lo pone de otra manera)

6. Filogenia Molecular (rRNA):

El rRNA es un CRONÓMETRO MOLECULAR EVOLUTIVO, es decir, los rRNA son moléculas que permiten medir distancias evolutivas entre organismos.

El número de diferencias es proporcional al número de cambios mutacionales estables fijados al DNA que codifica para cada molécula en ambos microorganismos.

CARACTERÍSTICAS DE UN CRONÓMETRO MOLECULAR:

• Distribución universal.
• (^) Función homóloga: No se pueden comparar las secuencias de moléculas no relacionadas funcionalmente ya que no se puede esperar que se presenten similitudes en su secuencia.
• Se han de poder alinear las secuencias a fin de identificar regiones de homología y heterogeneidad de secuencia.
• Las frecuencias de cambios han de ser proporcionales a las distancias evolutivas.
• La distancia evolutiva puede determinarse por las diferencias en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos (citocromos, ferredoxinas, rRNA).
• No tienen tasa de mutación elevada.

--- 16 S rRNA. Cronómetro molecular:

• (^) Aproximadamente 1500 nucleótidos.
• Constituyente de la subunidad 30 S del ribosoma en procariotas.
• Equivale al 18 S en eucariotas.
• Muy conservado desde un punto de vista de función.
• Secuencias no influenciadas por la degeneración del código genético -

que no sufre degeneración fácil por mutaciones del DNA cuando se duplica.

Las células eucarióticas modernas con sus orgánulos celulares distintivos fueron el resultado de eventos endosimbiónticos.

• Parece posible que el núcleo eucariótico y el aparato mitótico surgieron como una necesidad para asegurar la replicación y una partición ordenada del DNA una vez que el tamaño del genoma había aumentado al punto en que la replicación como una molécula no era factible.
• La amplia existencia de plásmidos en las bacterias sugiere que aún en los procariotas existen ventajas evolutivas para la segregación de información genética dentro de más de una molécula de DNA. Es posible imaginar cómo los cromosomas separados pueden haber surgido en una primitiva célula eucariótica de estructura similar a plásmidos y se segregaron dentro de la célula en un núcleo encerrado en una membrana. Probablemente las células del huso y del aparato mitótico pudieron haber evolucionado al mismo tiempo.

Hay ahora una fuerte evidencia de que la moderna célula eucariótica evolucionó en etapas mediante la incorporación interna de células de la línea nuclear descendiente de simbiontes fototróficos y organotróficos. Esta es la TEORÍA ENDOSIMBIÓNTICA de la evolución eucariótica.

La teoría postula que una bacteria aeróbica estableció su residencia en el interior del citoplasma de una eucariota primitiva y proporcionó a la pareja eucariotica energía a cambio de un ambiente estable, protegido y un suministro estable de nutrientes. Esta bacteria aeróbica podría representar el antecedente de la actual mitocondria.

Del mismo modo, la captación endosimbióntica de un procariota fototrófico pudo haber formado el eucariota fotosintético primitiva ya no dependiente de compuestos orgánicos para la producción de Energía. Simbionte fototrófico sería el antecedente del cloroplasto.

Con la evolución ambos casos han dado lugar a animales y plantas.

Para llegar en una evolución a la etapa eucariótica moderna, las primitivas células eucarióticas sacrificaron ciertas características procarióticas como la plasticidad genética, la sencillez estructural y la capacidad para adaptarse rápidamente a nuevos ambientes.

La mayor complejidad de la célula eucariótica significó que enfrentaría dificultades para adaptarse a la vida en ambientes extremos. Por estas razones, la evolución de los eucariotas no significó la muerte de los procariotas ni arqueobacterias. Las tres líneas continuaron su evolución.

TEMA 2 : Dominio Archaea

1. Introducción:

• Es un grupo muy variado donde encontramos una gran diversidad molecular que da lugar a fenotipos diferentes.
• Difieren de los eubacterias y los eucariotas. La ecología es lo que caracteriza a estos microorganismos.
• DISTRIBUCIÓN: hábitats anaerobios, hipersalinos y a elevadas temperaturas, es decir, son extremófilos.
• Son Metanógenos (productores de metano) y reductores del sulfato con cofactores exclusivos.
• El ser extremófilos implica que presenten adaptaciones estructurales químicas y metabólicas y hay aerobios y anaerobios litoautótrofos y heterótrofos.
• Su pared difiere de la de los demás dominios pero los podemos diferenciar también en Gram+ y Gram-.

Los lípidos polares que incluyen las arqueobacterias son los fosfolípidos , sulfolípidos y glucolípidos. Además contienen cantidades sustanciales de lípidos no polares , la mayoría de ellos derivados de compuestos isoprenoides.

Las membranas arqueobacterianas son únicas , sin embargo, están dispuestas naturalmente en una forma semejante a las membranas de eubacterias y eucariotas, es decir, tienden a formar espontáneamente bicapas lipídicas (polares en el exterior y apolares en el interior). -Los lípidos diéter de glicerol forman una verdadera bicapa. -Los tetraéteres se encuentran formando las monocapas lipídicas , que son equivalentes a las bicapas pero en las monocapas las mitades hidrofóbicas apuntan hacia dentro unas contra otras y están enlazadas en forma covalente. Los tetraéteres los contienen ciertos metanógenos y están ampliamente distribuidos en arqueobacterias extremadamente termófilas.

Debido a que la longitud de la mitad hidrocarbonada de los di- y tetraéteres es fija de 20 y 40 carbonos respectivamente, parece que esto limita a la hora de ajustar la anchura de las membranas a diferentes condiciones fisiológicas. Sin embargo, el espesor de las monocapas de tetraéteres se puede cambiar introduciendo pentaciclos dentro dela cadena hidrocarbonada permitiendo cierta flexibilidad en la composición y propiedades químicas de la membrana.

**** GENÉTICA **** Como los de las eubacterias, los genomas de las arqueobacterias consisten en una sola molécula circular cerrada en forma covalente de DNA. Tiene un contenido muy bajo de DNA por lo que son genomas pequeños.

Estudios sugieren que el patrón que se observa en los genes de la RNApol es representativo de cómo se acomodan los genes de las arqueobacterias y cómo se controlan en general. La RNApol presenta más de 4 subunidades y se han identificado varias moléculas de RNA mensajero poligénico que codifican para estos polipéptidos. Como en las eubacterias, las secuencias del promotor preceden la lectura abierta de las estructuras que codifican para los polipéptidos de la RNApol. Estos promotores parecen asemejarse a la Caja TATA (reconocida por la RNApol II) y a la Caja Pribnow (secuencia rica en A y T reconocida por las RNApol eubacterianas). Como en las eubacterias, también encontramos las secuencias Shine Dalgano y la terminación también es similar.

El % en G+C varía entre 21-68 % siendo mayor cuanto más termófila sea ya que los enlaces entre G y C ayudan a estabilizar el genoma.

El cromosoma bacteriano no presenta histonas pero existen unas proteínas que interaccionan con el material genético formando estructuras similares a nucleosomas dando estabilidad.

**** METABOLISMO **** En este grupo encontramos metanógenos autótrofos y heterótrofos. Muchas de las principales secuencias metabólicas son similares a las eubacterias pero varían a nivel enzimático y coenzimático para adaptarse a ambientes extremos. Además encontraremos ocasionalmente secuencias metabólicas sumamente especializadas.

3. Taxonomía:

Según la 1ª edición de Bergey’s, los Archaea se pueden dividir en:

• Metanógenos
• Reductores del sulfato

• Sustratos del tipo de CO 2. CO 2 + 4H 2 ---> CH 4 + 2H 2 O Como vemos, el H 2 es el donador de los electrones. Cuando crecen sobre CO 2 + H 2 los metanógenos son autotróficos, con el CO 2 sirviendo tanto de fuente de Carbono como de aceptor de electrones. La formación de metano a partir de CO 2 y H 2 se puede ver como un tipo de respiración anaeróbica, pero estudios bioquímicos indican que no existe un sistema convencional de transporte de electrones.
• Sustratos metílicos: CH 3 OH + H 2 ---> CH 4 + H 2 O
• Sustratos acetoclásicos: CH 2 COO -^ + H 2 O ---> CH 4 + HCO 3 - Se han aislado todas las formas morfológicas en este grupo como cocos ( Methanococcus ), bacilos ( Methanobacterium ), cocobacilos ( Methanobrevibacter ), espirilos ( Methanospirillum ).

Los estudios sobre su fisiología y sus propiedades moleculares han servido para clasificarlos en 8 grupos principales que contienen un total de 18 géneros. Se conocen metanógenos tanto Gram+ como Gram-.

La diversidad fisiológica de los metanógenos es más bien limitada. Todos los metanógenos utilizan NH 4 +^ como fuente de Nitrógeno y se conocen algunas especies que fijan el Nitrógeno molecular (N 2 ). Todos requieren Ni (forma parte de las coenzimas). También son importantes el Cobalto y el Hierro.

Otras características importantes:

• Viven en ambientes ricos en materia orgánica.
• Presencia de cofactores exclusivos que participan en las metanogénesis.
• Distribución: Fondo de los lagos, rúmen (estómago de los rumiantes), materia orgánica en descomposición.
• (^) Potencial biotecnológico: Producción de metano. Digestores anaerobios de fangos de aguas residuales. (experimento VOLTA: remover el fondo de los lagos, pillar un embudo y sale el metano por la parte estecha).

2.5.b) HALOBACTERIAS:

• Habitan en ambientes demasiado salinos, por ejemplo los depósitos de evaporación de sal y los lagos salados naturales o hábitats salinos artificiales (alimentos: salmueras). En general, en hábitats hipersalinos. Estos organismos no solamente son halófilos sino que su requerimiento de sal es muy alto, en algunos casos cercano a la saturación (32%).
• Viven en [sal] por encima de lo normal. Pero no solo es eso sino que tienen dependencia de altas concentraciones de sal --> 1’5M (9%). La mayoría viven entre 2 y 4M (12-15%).
• Algunos géneros de halófilos son: Halococcus , Haloferax , y Halobacterium siendo este último el 1º en ser descrito.
• Respecto a su fisiología, podemos decir que todas las bacterias halófilas son organótrofas y la mayor parte de las especies son aerobios obligados. La mayoría utilizan aminoácidos o ácidos orgánicos como fuentes de energía y requieren varios factores de crecimiento.

participación de pigmentos de clorofila. Esto es posible gracias a una fotofosforilación oxidativa y a la síntesis e inserción dentro de sus membranas de una proteína llamada Bacteriorrodopsina la cual da lugar a una membrana purpúrea. Así, estas bacterias, en condiciones de aereación altas, cambian de un color naranja o rojo a uno más púrpura- rojizo.

2.5.c) THERMOPLASMA:

• Es una arqueobacteria sin pared celular.
• Lo que caracteriza al grupo es que son extremófilas aunque su estatus filogenético exacto es confuso.
• Es un organótrofo aerobico acidófilo.
• Se desarrolla óptimamente a 55ºC y pH=2 en un medio complejo complementado con extracto de levadura.
• Para sobrevivir bajo las tensiones osmóticas de vivir sin una pared celular y para contrarrestar los extremos ambientes duales de bajo pH y alta temperatura, ha evolucionado una membrana celular de estructura química única. Ésta contiene un lipopolisacárido , un lípido tetraédrico con unidades de manosa y glucosa en una fracción importante. La membrana contiene también glucoproteína pero no esteroles. Juntas éstas y otras moléculas logran que la membrana de Thermoplasma sea estable en condiciones ácidas calientes.
• Thermoplasma, posiblemente, contiene el genoma más pequeño de todas las bacterias de vida libre.

• La especie más representativa es la Thermoplasma acidophilum cuyo hábitat son las pilas de minas de carbón ricas en pirita (FeS) que es oxidado a ácido sulfúrico por bacterias quimiolitotróficas (Tª = 55-59 ºC, pH = 1-2). También hay otra llamada Thermophilus volcanicum.
• Thermophilus picrophilus es interesante por el hecho de que puede crecer a pH = 0. Ésta si que tiene pared celular.
• Ferroplasma tampoco tiene pared celular pero no es termófilo sino que oxida el ión ferroso a Fe. Vive en minas de pirita.

2.5.d) HIPERTERMÓFILOS: [rama filogenética] (solo dijo:) Se trata de cocos hipertermófilos que se pueden clasificar en 3 órdenes:

• Thermococcales : Son anaerobios estrictos. Crecen entre 88-100 ºC. Ejemplos:
• Thermococcus : esféricos, extremadamente termófilos, aparecen en aguas termales submarinas. Presentan flagelos polares por lo que son sumamente móviles. Organótrofo. Azufre como acptor de electrones.
• Pyrococcus : Tª óptima a 100 ºC. En general similares a los anteriores en todo excepto en el % G-C y la Tª óptima.
• Methanopyrococcus : Metanogénica (CO 2 + H 2 ), capa de desarrollarse sobre los 100 ºC. Bacilo Gram+. Es el hipertermófilo más antiguo.
• Archaeglobales : Hipertermófilos. Ejemplos:
• Archaeclobus : Como todas las arqueobacterias extremadamente termófilas, usan el S 0 como aceptor de electrones para su crecimiento anaeróbico pero, además, es reductora de sulfatos. Son esferas irregulares, móviles y su Tª óptima es de 83 ºC. Debido a su capacidad reductora de sulfatos produce pequeñas cantidades de metano compartiendo características metabólicas con los metanógenos.
• Ferroglobus.