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SEMINARIO DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Clasificación: Organización de los organismos en grupos taxonómicos en base a sus similaridades y relaciones.
Nomenclatura: Asignación de nombres a los grupos taxonómicos formados.
Identificación: Proceso de inclusión de un nuevo aislado bacteriano en uno de los grupos taxonómicos previamente establecidos.
TÍTULO BACTERIANO (ufc/g) = media de colonias / Vol * dilución (10 -x^ ) /g
Técnica del número más probable: Hacemos crecer las bacterias en tubos de caldo (turbidez: crece). ¿Por qué todavía se utiliza este método? Hay bacterias que no crecen en Agar. En tubos es más fácil conseguir condiciones anaeróbicas. También se utiliza cuando el microorganismo es muy pequeño. Es un método muy estandarizado. Hacemos repeticiones de las diluciones y consideramos la posibilidad de crecer o no crecer.
Características morfológicas
Tinción de GRAM (método de Hucker): Determinar la morfología y el carácter Gram. Cristal violeta, mordiente lugol (facilita la unión). Safranina para teñir las gram-.
Medio diferencial MacConkey: medio selectivo para enterobacterias (lleva una sal biliar) y diferencial (los que fermentan lactosa (piruvato, ácido, baja el pH, lleva un indicador y las lactosa positiva se ponen rosa y los que no se quedan del color del medio: marrón).
Producción de pigmentos Medio King A (para piocianina, observar coloración) y King B (Para pigmentos fluorescentes, iluminar con luz ultravioleta (<260nm))
Características fisiológicas
Prueba de la citocromo-oxidasa: si tiene la citocromo-c oxidasa en su cadena de transporte de electrones. Reactivo tetrametil-p-fenilendiamina (aparece un color en el primer minuto, si no pasa nada es negativo (cuidado, si se deja más tiempo, puede dar un falso positivo). Positivo no tiene este citocromo (no tiene por qué no tener cadena transportadora de e - ).
Prueba de la catalasa: Para degradar radicales oxidantes, como el agua oxigenada, ¿para qué lo tienen los microorganismos? Porque en la cadena se van desprendiendo este tipo de radicales oxidantes, que son peligrosos y los microorganismos han desarrollado enzimas para degradarlos). Si se producen burbujas: catalasa+. Esta enzima está presente en la mayorían de
las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, siendo una excepción importante los miembros del género Streptococcus.
Crecimiento a distintas temperaturas: Determinar la capacidad de una determinada bacteria a distintas temperaturas. Observar diariamente, el crecimiento bacteriano se pone de manifiesto por la turbidez del medio de cultivo.
Características metabólicas
Metabolismo de carbohidratos
Prueba de la óxido-fermentación (O/F) (Hugh-Leifson) Nos va a decir qué tipo de metabolismo tiene. Lleva un indicador de pH, si el microorganismo utiliza el azúcar (utilizaremos glucosa) se producirán productos ácidos (amarillo) (si no, azul (si se vuelve un poco ácido por utilizar las peptonas) o verde, pH neutro). Ponemos dos tubos, uno con parafina (sin dejar difundir el oxígenometabolismo fermentativo) y otro sin (difundiendo el oxígenometabolismo oxidativo). Tras la incubación, los tubos que muestren una coloración amarilla se considerarán positivos, mientras que los que aparezcan verdes o azules se considerarán negativos. Tubo en condiciones de aerobiosis/tubo en anaerobiosis: +/+: Metabolismo fermentativo +/-: Metabolismo oxidativo -/+: Metabolismo fermentativo -/-: No degrada el azúcar ensayado
Prueba del ONPG: Estructuralmente tiene un efecto similar al de la lactosa pero no utiliza la permeasa (para bacterias que tienen beta galactosidasa pero no tiene permeasa). Disco con ONPG y un tampón de pH. Si se rompe el ONPG da un color amarillo (+). Incoloro (-).
Prueba Kligler: prueba de la utilización de azúcares y producción de SH 2. Prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae. Con esta prueba se pretende determinar la capacidad bacteriana de: fermentación de glucosa, fermentación de lactosa, aerogénesis, reducción de compuestos de azufre con producción de SH 2. Agar DSI ( medio dos azúcares hierro ). Con glucosa y lactosa. Con tiosulfato sódico. Resultados: amarillo (glucosa+ y lactosa+), si se ven burbujas de gas (del metabolismo de la glucosa, desprendimiento de CO2) cepas aerogénicas (que producen gas); si se vuelve negro (reduce el tiosulfato y produce sulfhídrico, en el medio va una sal de hierro que conjuntamente producen un precipitado negro, microorganismo sulfhídrico+), si la parte de arriba es roja es lactosa- (fondo amarillo nos indica que consumió en primer lugar la glucosa).
Prueba del rojo de metilo (RM). Diferenciar tipos de fermentaciones (con diferente proporción de productos ácidos, mirar diapos). Prueba positiva: rojo (pH ácido, se han acumulado ácidos) fermentación ácido mixta ; Prueba negativa: amarillo.
Prueba del Voges-Proskauer (VP). Detectar la producción de acetil-metilcarbinol (acetoína)
Prueba de la fenil-alanina desaminasa (APP). Determinar la capacidad de la bacteria de metabolizar la fenil-alanina por desaminación directa en aerobiosis. Se analiza si la alanina se puede desaminar produciendo APP (ácido fenilpirúvico). Estos, en presencia de cloruro férrico, se ponen verde oliva. (Negativo: color anaranjado).
Otras características enzimáticas
Prueba de reducción del nitrato. A ver si el microorganismo tiene la capacidad de usar el nitrato como último aceptor de electrones (capacidad de una bacteria de reducir el nitrato a nitrito y éste a NH 3 (reducción asimilatoria) o a N 2 (reducción desasimilatoria)). Caldo nitrato. Con campana de Durham para recoger gas. Incubamos y añadimos dos reactivos, agitamos y: FASE I: si se pone rosado-rojo la prueba es positiva (nitratonitrito); si se queda incolora (son incapaces de reducir los nitratos). FASEII: ¿Y si de nitrito ha pasado a nitrógeno? Los tubos que hayan dado negativo le agregamos Zinc, si hay nitratos en el medio la prueba era de verdad negativa. Pero si tras añadirle Zinc sigue estando incoloro la prueba es positiva (dos razones: reducción asimilatoria, sin gases en la campana, reducción desasimilatoria, con gas en la campana).
Prueba de la ureasa. A ver si el microorganismo tiene la enzima que rompe la urea (dando lugar a amoniaco y CO 2 ). Se produce una alcalinización. Viene muy bien para identificar a Helicobacter pillori (que utiliza la ureasa para crear un ambiente neutro dentro de la salida del estómago (pH muy ácido) o para diferenciar los Proteus dentro de las proteobacterias (de los poquitos que utilizan urea). Agar Christensen urea. Si se pone púrpura es positivo (se produce amoníaco, se basifica el medio), si se queda del mismo color no se utiliza la urea.
Prueba de la hidrólisis del Tween-80 (lipasa). Determinar la presencia del enzima extracelular lipasa. Las bacterias que poseen este enzima son capaces de degradar el Tween-80. Utilizamos el Agar Sierra, que lleva el Tween-80 (compuesto éster mono-oleico del sorbitano polihidroxietileno que libera ácido oleico que es el compuesto que se detecta en la prueba) Y
cloruro cálcico; entre ellos reaccionan y forman cristalitos: Sombra blanca pequeños cristales de oleato cálcico: prueba positiva, utiliza lipasa.
Prueba de la hidrólisis de la caseína (caseinolisis). Determinar la capacidad de una bacteria de hidrolizar la caseína de la lecha. Medio con leche desnatada (mucha caseína). Prueba positiva: alrededor del microorganismo se forma un aclaramiento del medio.
SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA MINIATURIZADOS
Más información en el guión de prácticas Microbiología II 2013-
