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PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA
1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Medios de cultivo indefinidos o naturales: en su preparación siempre se incluyen componentes cuya identidad química y/o proporción es desconocida. El más utilizado es el caldo común o su versión solidificada con agar.
- Caldo común. Compuesto de extracto de carne, peptona bacteriológica y cloruro sódico.
- Medio base para la fermentación de azúcares. Compuesto de extracto de carne, peptona bacteriológica y cloruro sódico. Se añade solución de púrpura de bromocresol, un indicador de pH que vira a amarillo cuando se acidifica. En los tubos se introduce una campana Durham en posición invertida para detectar la presencia de gases en la fermentación.
- Agar nutritivo. Misma composición que el caldo común, pero con agar.
- Agar de McConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH que vira hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram +.
- Agar al Verde Brillante. Contiene lactosa, sacarosa, una elevada concentración de aminoácidos, verde brillante como inhibidor de crecimiento de muchos fermentadores y rojo de fenol como indicador de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminoácidos y generan color rosa. Los fermentativos o no crecen o dan color amarillo.
- Agar de tres azúcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa, citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos inclinados. Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica.
- Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Medio rico lactosado con 2 colorantes, eosina y azul de metileno, que funcionan como inhibidores del crecimiento de Gram +. En este medio, la actividad fermentativa de E.coli genera colonias negras con brillo verde metálico debido a la formación de un complejo entre la eosina y el azul de metileno en pH bajo, mientras que la menor actividad fermentativa de E. aerogenes genera colonias rosas/negras sin reflejos.
- Caldo de urea-Indol. Permite determinar la presencia de la actividad ureasa y la producción de indol a partir de triptófano. La actividad ureasa provoca la degradación de la urea presente en el medio a CO2 y amonio, con la consiguiente alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol desde el verde original al azul intenso. Si se quisiera determinar la producción de indol bastaría añadir al medio el reactivo de Kovacs, siendo positiva si se produce cambio de color al rojo.
- Agar MRS. Contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema comercial para la eliminación del oxígeno.
2. ESTERILIZACIÓN
Es la destrucción de todo microorganismo. Los medios con contenido acuoso se esterilizan en el autoclave mediante calor húmedo. Se realiza habitualmente a 1 atm y 121ºC durante 15 ó 20min. En el caso del caldo para la fermentación de azúcares, se suele esterilizar a menor presión (0.5 atm y 111ºC) para evitar su "caramelización" y, en el de la urea, conviene esterilizarla independientemente por filtración. El material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en el Horno Pasteur y después se envuelve en aluminio o se introduce en un contenedor y se mantiene en el horno durante 2h a 160ºC. El calor directo del mechero se utiliza para los portainóculos (asa de siembra) y para flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.
3. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
Proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos denominada inóculo de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados.
Bacterias de la colección y temperaturas de crecimiento: Escherichia coli 37ºC Gram negativa Pseudomonas aeruginosa 37ºC Gram negativa Staphylococcus aureus 37ºC Gram positiva Micrococcus luteus 30ºC Gram positiva Nocardia corallina 30ºC Gram positiva Bacillus cereus 37ºC Gram positiva (forma esporas)
4. FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Son las reacciones de obtención de energía que no requieren la participación de una cadena de transporte de electrones. En el caso de azúcares se trata de procesos de óxido-reducción capaces de regenerar NAD+ y que, comúnmente, tienen como productos finales alcoholes, ácidos… acompañados o no por la formación de gases. En estas prácticas se observa la capacidad de fermentación de 3 azúcares: glucosa, sacarosa y lactosa. La producción de ácidos se observa por el viraje a amarillo del púrpura de bromocresol. La producción de gas se observa por su acumulación en las Campanas Durham, de donde habrá desplazado parte del líquido inicialmente incluido.
5. OBSERVACIÓN DE LAS BACTERIAS
• OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA
Forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado...), presencia de brillo, color, etc. Sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Se puede observar la turbidez: si crecen uniformemente (son facultativas), si crecen en el fondo (son anaerobias), si crecen en la zona superficial (son aerobias), si producen pigmentos, etc. Si la placa no es homogénea significa que hay contaminación.
• OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
Como la mayoría de las bacterias son incoloras, se emplean colorantes o una óptica especial de contraste en el microscopio. Movimiento bacteriano. Generalmente se emplea el contraste de fase permite observar a las bacterias vivas y determinar características como su movimiento. Para ello, se dispone una gota de cultivo líquido sobre un portaobjetos y se tapa con un cubre, de forma que se establezca una delgada película entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x y el condensador anular. Se distinguen bacterias con flagelos polares (se mueven en zig-zags muy rápidos) y perítricos (movimientos más suaves y ondulados alternados con giros). En las inmóviles también se producen desplazamientos por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observación. Todas tienen movimiento browniano. Forma bacteriana. Coco (redonda) o bacilo (alargada).
6. TINCIONES
Se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Después, se deshidrata el frotis por calentamiento tras pasar
8. ANTIBIOSIS
Antibiograma cualitativo : permite determinar a qué antibióticos es sensible la bacteria.
- Sensible: diámetro del halo de inhibición (zona donde la bacteria no crece porque actúa el antibiótico) mayor a 15mm.
- Resistente: diámetro del halo menor a 13mm.
- Intermedio: diámetro del halo entre 13 y 15mm. Antibiograma cuantitativo: permite determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de un antibiótico frente a la bacteria, es decir, la concentración a la que la bacteria deja de crecer. Se representa el diámetro del halo frente al log de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos se ajustan a una recta de la que se extrapola la concentración necesaria para generar un halo de 15mm, que será considerada la CMI de este antibiótico frente a la bacteria.
9. ACTIVIDAD CATALASA
Ensayo para determinar si la bacteria problema tiene capacidad para eliminar el peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones metabólicas oxidativas del metabolismo aerobio. La enzima encargada de degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios. Si la bacteria es aerobia tiene actividad catalasa, si es anaerobia no. El ensayo consiste en añadir una gota de agua oxigenada sobre una colonia del cultivo y observar si se desprenden burbujas de O2 como consecuencia de la actividad enzimática de la catalasa: 2H2O2 2H2O + O2.
10. AISLAMIENTO DE BACTERIAS LÁCTICAS Y PRODUCCIÓN DE YOGUR
Aislar bacterias de yogur ( Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus ) mediante el medio MRS, un medio que permite el crecimiento de muchos lactobacilos. Las bacterias se emplean para inocular leche y comprobar su capacidad fermentativa. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos. El tubo inoculado (control +) gelifica porque las bacterias acidifican el medio, pero el de control – no lo hace.
11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
Escherichia coli y Enterobacter aerogenes fermentan lactosa Samonella typhimurium y Morganella morganii no fermentan lactosa Determinación de bacterias fermentadoras de lactosa. Se extienden las diluciones 10-4 y 10-3 sobre 2 placas de agar MacConkey. Las fermentadoras de lactosa (E. coli y Enterobacter) forman colonias rojas y las no fermentadoras amarillas. Se cuentan las colonias rojas/rosáceas y se multiplican por los factores de dilución. Se cogen colonias rojas/rosas y se extienden haciendo zig-zag sobre una placa de agar EMB, incubando a 37ºC. Sobre este medio, E. coli genera colonias negras con reflejos verdes metalizados y Enterobacter colonias más rosáceas y nunca reflejos.
Determinación de Salmonella y Morganella****. Se extienden las diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante. Las no fermentadoras ( Salmonella y Morganella) generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosa y las fermentadoras no crecen o viran hacia el amarillo. Salmonella y Morganella se reinoculan en caldo de urea-indol ( Morganella es ureasa +. El pH se basifica. Genera color rosa, mientras que con Salmonella permanece amarillo) y en TSI ( Salmonella aparece con precipitados negros, por producción de SH2 que genera FeS. Usa como aceptor de e- el tiosulfato).
12. TRANSFERENCIA GENÉTICA ENTRE BACTERIAS GRAM –
• CONJUGACIÓN
Una cepa portadora de un plásmido, denominado conjugativo, es capaz de transferir una copia de éste a una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. Este mecanismo es el causante primario de la difusión de genes de resistencia a antibióticos. Un transposón es un fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localización dentro de la misma molécula de DNA o entre moléculas distintas (por ej., de plásmido a cromosoma o al revés) y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a antibióticos.
Se transfiere un transposón que confiere resistencia a Kanamicina desde E.coli a Salmonella utilizando plásmidos derivados del conjugativo y promiscuo RP4. Plásmido pUT:
- Origen de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la proteína π desde un bacteriofago lisogénico λ (λpir) (sólo si es lisógeno de λ va a tener esa proteína π).
- Origen de transferencia del plásmido conjugativo RP4.
- Gen de la transposasa ( tnp ) (actividad transposasa, permite cortar y que salga el gen).
- Gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O de recombinación (es transferible mediante la actividad transposasa).
- Gen de resistencia a Ampicilina (una β-lactamasa, bla ).
- Para que sea transferido, este plásmido requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en E. coli S17-1λpir.
Se emplean las cepas de E.coli CC118λpir y S17-1λpir transformadas con el plásmido pUT. Sólo la cepa S17-1λpir es capaz de transferir el plásmido a otras cepas, pues contiene en el cromosoma genes de RP4 necesarios para la conjugación. La cepa CC118λpir se emplea como control – en la transferencia. El receptor, la cepa de Salmonella, es resistente a Estreptomicina y a Rifampicina. Esta cepa carece de la proteína π (el plásmido pUT no puede replicar en ella).
Sobre una placa de agar común, se depositan 2 filtros estériles de nitrocelulosa separados que actúan de soporte sólido para la conjugación. Sobre uno de los filtros se añade E.coli CC118λpir y sobre el otro S17-1λpir. Al día siguiente, se toma cada filtro con las pinzas y se introducen en tubos estériles. Se añade SO4Mg, se agita y se extienden 100 μl en 2 placas de selección con Rifampicina y Kanamicina. Sólo aparecerán colonias en la conjugación entre E. coli S17-λpir y Salmonella. En el control – no crece nada.
• TRANSFORMACIÓN
Proceso por el cual el DNA es introducido dentro de un microorganismo. Puede ser un proceso natural o producirse de forma artificial mediante tratamientos químicos o físicos. En esta práctica se introducirán plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento químico de éstas (choque térmico).
La cepa de E. coli JM83 no tiene actividad β-galactosidasa, aunque dispone de las permeasas específicas de lactosa. En ausencia de plásmidos, esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz
Si en las placas de agar MacConkey con kanamicina aparecen colonias rojas, el fago se ha
integrado en el cromosoma confiriendo a esta bacteria resistencia al antibiótico de selección y capacidad de utilización de lactosa mediante transducción: lleva resistencia a la kanamicina y β- galactosidasa, fermenta lactosa y cambia el pH.
Ciclo lisogénico Ciclo lítico: más frecuente. En la dilución 10^(-1) puede estar todo lleno de un “césped” y no
apreciarse nada. Según se va diluyendo va habiendo menos.
14. CRECIMIENTO BACTERIANO
Seguimiento del crecimiento de un cultivo estático de E. coli y observación del efecto producido sobre éste por antibióticos como la Ampicilina y la Estreptomicina.
Se mide el pH de la muestra para valorar la producción de ácido como consecuencia del
metabolismo bacteriano. Después se mide la turbidez o densidad óptica en un colorímetro a una longitud de onda de 550nm. Este valor es un parámetro proporcional a la concentración de masa celular hasta un valor de 0,5, a partir del cual se pierde esta proporcionalidad. Por eso, cuando se obtenga un valor superior a 0,5 se procederá a la dilución (1 ml de cultivo + 4 ml de caldo) con medio de cultivo. Así, el valor que se obtenga, multiplicado por el factor de dilución (5 x),
mantendrá la proporcionalidad con la concentración de la masa bacteriana.
Cuando los cultivos alcancen una DO de 0,4-0,5, se añadirán antibióticos (Ampicilina, Estreptomicina, Ampicilina + Estreptomicina y Estreptomicina + Ampicilina).
Los resultados de DO de cada uno de los experimentos serán representados sobre papel semilogarítmico. De estas gráficas se podrá observar:
- Fase exponencial y entrada en fase estacionaria (fase de latencia no se ve en este medio y en estas condiciones y fase de muerte tarda mucho en llegar).
- Tiempo de generación: calculable a partir de la pendiente de la gráfica en su fase exponencial. Aumenta exponencialmente.
- Efectos de los antibióticos: lítico para Ampicilina (bacteriolítico. Lisa a la bacteria) y no lítico para Kanamicina (bacteriostático, actúa sobre la síntesis de proteínas. No lisa a la bacteria).
Al echar antibiótico la absorbancia baja. Amp + Kan: la absorbancia baja mucho Kan + Amp: valor más intermedio
Para preparar 1mL de una dilución 1:20 de lactosuero se pipetearían 50μL.
Para preparar 2 diluciones seriadas 1/5 a partir de una disolución 100mg/mL, la concentración de dichas disoluciones serían 20 y 4 mg/mL.
Las placas siempre se ponen a incubar boca arriba para evitar que la condensación del agua
caiga sobre los cultivos impidiendo el crecimiento.
Diluciones seriadas:
Dilución 1/4. Volumen final=100 μL 25μL dilución inicial + 75 μL agua
5 diluciones seriadas. Volumen final siempre 100 μL:
10mg/ml – 2,5mg/ml – 0,625mg/ml – 0,156mg/ml – 0,039mg/ml
75μL 75μL 75μL 75μL
Cinicial x Vinicial = Cfinal x Vfinal
Contar colonias: dividir la placa en cuadrantes homogéneos y multiplicar el nº obtenido en un cuadrante por el nº de cuadrantes totales. La placa debe tener entre 30 y 300 colonias de bacterias. Hacer la equivalencia de colonias/ml.
