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Prácticas de Microbiología-Informe
Introducción En estas prácticas de microbiología, de las cuales tratará este informe, vamos a familiarizarnos con técnicas de laboratorio propias de este campo y llevaremos la práctica fundamentos de las clases de teoría. Además, intentaremos averiguar a través de dichas técnicas cual es la bacteria problema que nos ha sido asignada, comparando los resultados de las diversas pruebas que realizaremos con las de las 6 bacterias de la colección: Micrococcus luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylocccus aureus, Nocardia corallina y Bacillus cereus. No obstante, también trabajaremos con otras bacterias y también con virus.
Medios de Cultivo En estas prácticas se hace indispensable la utilización de medios de cultivo estériles los cuales en su mayoría estarán preparados, debido al escaso tiempo del que disponemos. La mayor parte de estos medios serán indefinidos o naturales, lo que implica que siempre tengan en su composición una parte que desconocemos, usaremos sobre todo caldo común o su forma solidificada con agar, que permiten el crecimiento de casi todas las bacterias. Pero, esto no quiere decir que sean los únicos medios de cultivo que usaremos a lo largo de las prácticas, también usaremos otros como el agar de McConkey donde solo crecen las Gram negativas u otros con indicadores de pH, etc.
Preparación:
-Caldo común: del cual prepararemos 1L el primer día, su composición aproximada será de 3g de extracto de carne, 10g de peptona bacteriológica y 5g de cloruro sódico, además añadiremos algo de Magnesio. Todos estos componentes se añaden a un matraz y se disuelven en agua, una vez realizado se repartirán 5mL por tubo y resto se dejará en matraces para su posterior uso.
-Agar nutritivo: también se preparará el primer día, tiene la misma composición que el agar común con la única diferencia que se le añadirán 15g de agar por litro, cuando aún está caliente se agita para hacer una disolución homogénea y se extiende en placas.
-Medio base para la fermentación de azúcares: también se preparará el primer día, su composición es la siguiente, 0´4g de extracto de carne, 4g de peptona bacteriológica y 2g de cloruro sódico. Una vez los disolvemos echamos 0´9mL de púrpura de bromocresol un indicador de pH que vira a amarillo en pH menores de 5´2, permitiendo la detección de producción de ácido en el medio. El medio se reparte en 3 volúmenes iguales a los que se echa 1,35g de glucosa, sacarosa y lactosa respectivamente, después se reparten en tubos con campanas durham, que se esterilizarán.
A parte de estos medios que prepararemos, usaremos otros como el ya mencionado agar de McConkey, AVB o agar verde brillante, agar de tres azúcares de hierro o TSI, agar de eosina-azul de metileno o EMB, caldo de urea o agar MRS.
ADVERTENCIA: TODOS LOS MATERIALES QUE USAREMOS SERAN
ESTERILIZADOS ANTES DE REALIZAR CUALQUIER PRÁCTICA, YA SEA
CON EL MECHERO, ALCOHOL O EN EL AUTOCLAVE.
Siembra de microorganismos Procedimiento: cada pareja deberá sembrar las bacterias de la colección y su bacteria problema en los tubos de caldo común y agar inclinado, además deberá sembrar su bacteria problema y una de las 6 de la colección (en nuestro caso Bacillus cereus ) en los tubos de azúcares de glucosa, lactosa y sacarosa todos preparado previamente. Debido a la formación de esporas el último que inocularemos será el Bacillus cereus en todos los tubos, para que no contamine el resto. Para inocular realizaremos los siguientes pasos, en primer lugar enceremos nuestro mechero, el cual nos proporcionará un radio de esterilización de unos 35cm debido la formación de un paraguas por corrientes de convección; en segundo lugar, esterilizaremos el asa de siembra en el mechero poniéndola al rojo vivo un par de veces, una vez enfriada realizaremos el tercer paso, cogeremos el asa con 4 dedos de una mano, dejando el meñique libre para sujetar el tubo con la muestra o a inocular, con la otra mano enroscaremos o desenroscaremos y tocaremos con la punta del asa de aspecto circular las colonias de la bacteria que vayamos a inocular y por tensión superficial se mantendrá en la punta, por último inoculamos en caldo común simplemente agitando la punta dentro del tubo (al igual que si lo hacemos en los tubos de azúcares) y si es en agar inclinado zigzagueamos suavemente por la superficie del agar hasta el extremo más próximo a la boca del tubo, es decir, desde el fondo hasta arriba. Cada vez que cambiemos de bacteria a inocular flamearemos el asa, así como la boca del tubo (levemente) para evitar que se contaminen con otros organismos. Todo ello dentro del radio estéril que proporciona el mechero, siempre con la precaución de no quemarnos. Finalmente debemos inocular nuestra bacteria problema en una placa Petri, para ver la forma, tamaño y color de las colonias que forman del modo que explica el siguiente dibujo:
Una vez hecho esto con todas y cada una de las bacterias las llevaremos a incubar a 37ºC incluyendo nuestra bacteria problema, menos aquellas que se incuban a 30ªC que son N.Corallina y M.Luteus u otras bacterias problemas de otros grupos.
Fermentación de azúcares
+++ +++ +++ + + + Bacteria problema 2b
Otra cosa realizaremos conjuntamente a la observación de la fermentación, será la observación de los tubos de agar inclinado y caldo común donde observaremos el color de las bacterias y en el caso de la placa Petri con la bacteria problema también el tamaño de las colonias formadas.
Bacteria Caldo común Agar inclinado Color Tamaño B.Cereus Masa en el fondo y anillo de biofilm superficial
Borde ondulado o irregular, sin relieve aparente
Blanquecino o lechoso
E.Coli Agua bastante turbia Borde liso con poco relieve
Translucido, turbio (^) -
P.Aeruginosa Botón en la base del tubo
Rugosa de borde muy irregular
Más o menos transparente
N.Corallina Acumulación en la superficie
Rugoso Blanco (^) -
M.Luteus Botón en el fondo^ Borde liso y sin elevaciones o abultamientos
Amarillento, amarillo o verde- amarillo
S.Aureus Botón en el fondo, con un aparente anillo en la superficie y algo turbio.
Borde irregular muy ondulado sin abombamientos
Blanquecino o blanco
Problema 2B Botón en el fondo y algo de biofilm
Borde liso y sin relieve aparente
Translucido, blanquecino
Aprox. 1mm
Observación microscópica Esta observación consta de dos partes una in vivo, para ver el movimiento y forma de la bacteria problema y de E.Coli y P.Aeruginosa, y la segunda una tinción de gram para ver si es gram positiva (azul) o negativa (rojo) dependiendo del color con que se tinte.
En la primera cogeremos 3 portaobjetos, los cuales pasaremos por el mechero (el cual estará la mayor parte de las prácticas encendido) un par de veces para mantener la esterilidad. Después, como siempre flamearemos el asa, cogeremos una gota de la primera de ellas, la que queramos y la ponemos sobre el porta, tapamos con el cubreobjetos y las observamos al microscopio de contraste de fases, en la E.Coli observaremos un movimiento flagelar peritríco (Fig.1) y en P.Aueruginosa un
movimiento polar en forma de zig-zag (Fig.2), que compararemos con el de nuestra bacteria problema. En nuestro caso después de la observación in vivo y hasta el momento hemos averiguado que forma colonias blanquecinas, de 1mm aproximadamente, con movimiento peritríco y forma bacilar al igual que E.Coli.
En la segunda parte, haremos tres portaobjetos en el puente de tinción para ello necesitaremos un cristalizador donde echar los restos de tinte, el propio puente de tinción y diversos colorantes. El procedimiento es el siguiente, en la primera placa: en esta solo depositaremos un frotis de E.Coli , el cual deshidrataremos en el mecehro pasando el porta para fijarlo, después cubriremos durante dos minutos con cristal violeta que tinta las gram+, después lo volcamos y cubrimos con lugo un minuto para reforzar la interacción del colorante con la pared bacteriana, lavar con alcohol durante 30s y limpiar con agua enseguida para evitar el arrastre del colorante, por ultimo trataremos con safranina durante 2 minutos, lavar con agua abundante, secar al aire y mirar al micro, donde se observaran la gram negativas en rojo y las positivas en azul.
En os otros dos portas realizaremos los mismos pasos con la única diferencia que el frotis será de dos bacterias, uno tendrá E.Coli y nuestra problema y en el otro las dos de la colección. Tras observar al micro todas las bacterias tintadas eran rojas en las 3 preparaciones por tanto sacamos en conclusión que nuestra bacteria problema es Gram-.
Actividad catalasa En esta parte simplemente echaremos agua oxigenada sobre las colonias de la placa para ver si nuestra bacteria tiene actividad catalasa positiva o negativa, en caso positivo convertirá el agua oxigenada en agua y oxígeno y saldrán burbujas en caso negativo la bacteria morirá y no saldrán burbujas. Al echarla sobre nuestra placa surgió una fuerte efervescencia lo que indicó que era catalasa positiva.
Tira API20E Esta práctica consiste en rellenar un tira API20E, que consta de unos pocillos en forma de bota que iremos rellenando con determinados sustratos, enzimas y/o azúcares. Esta tira nos permitirá detectar cuales de estas sustancias fermenta nuestra bacteria problema, algunos de estos pocillos serán llenados hasta el límite, otros hasta el menisco y algunos deberán ser completados con aceite de parafina, todo esto se realizará con materiales estériles y cómo no, debajo del mechero. Una vez llenadas las celdillas, la tira se introduce en una cámara plástica con humedad, tras esta prueba deberemos saber casi con seguridad cual es nuestra bacteria, pero sobre todo si es o no una enterobacteria. Estos fueron los resultados:
resultados de las distintas pruebas realizadas coinciden con las de esta bacteria para cerciorarnos de que es la misma. Al ser una enterobacteria tiene movimiento perítrico, es gram negativa, catalasa positiva, no forma esporas, fermenta cualquier azúcar menos melibiosa, produce H2S y es citrato positiva. Ahora si podemos constatar que realmente nuestra bacteria problema es la Citrobacter freundii.
Prueba de antibiosis Esta prueba consiste en depositar unos discos con una determinada cantidad de antibióticos sobre una placa Petri, en la cual hemos extendido unas bacterias previamente, en nuestro caso E.Coli y C.Freundii. En el caso de la problema pondremos unos discos de cloranfenicol, cefalotina, tetraciclina, a.nalidíxico, eritromicina, estreptomicina y trimetoprim. Esta operación se realizará con unas pinzas esterilizadas con el mechero, con precaución de que no estén demasiado calientes y debajo del mismo. Con estas pruebas mediremos la sensibilidad de las bacterias a determinados antibióticos según el halo que generen, resistente menor de 15mm y sensible mayor de 15mm, en su mayoría la citrobacter era sensible a todos, menos a cefalotina y eritromicina a los cuales era prácticamente inmune. Con la E.Coli realizaremos la misma operación pero con un solo tipo de antibiótico, para calcular la concentración mínima inhibitoria, a través de una gráfica que deberemos realizar representando concentración-tamaño halo. La concentración mínima inhibitoria se calcula extrapolando desde los 15mm hacia arriba en la gráfica, pero como nosotros teníamos un halo ya de 15mm, podeos decir que la CMI es de 1,6 microgramos. Dicha gráfica irá en la siguiente página con los resultados obtenidos.
Análisis de aguas contaminadas En esta parte trataremos de averiguar por diversos medios que bacterias tenemos en una muestra de aguas contaminadas, de las cual haremos 5 diluciones, para después calcular el número de bacterias que teníamos en cada una de ellas. Solo tendremos que detectar cuales de las 4 bacterias posibles tenemos ( M.Morganii, S.Typhi, E.Coli o E.Aerogenes ). De las tres últimas diluciones extenderemos 0´1 mL sobre placas de agar común, que incubaremos y recontaremos las colonias para multiplicarlas por el factor de dilución y obtener el número aproximado de bacterias originales que teníamos en cada una, los resultados fueron los siguientes: 10-3^ = 53x10 3 =530000,
10 -4=27x10 4 =270000 y 10 -5=12x10 5 =1200000.
Para el siguiente paso, extendemos 0´1mL de las disoluciones 10-3^ y 104, en agar de McConkey, en las cuales después de incubar contaremos el número de colonias rosas (fermentadoras de lactosa: E.Coli O E.Aerogenes ) y cremas (no fermentadoras), y además si tenemos dos tipos de fermentadoras el porcentaje de cada una, también tras realizar este paso sembraremos colonias rojas en agar EMB para determinar si son de Coli (verdes) o Aerogenes. Nuestro resultados fueron los siguientes: en 10 -4^ ninguna
colonia y en 10-3^ , 33 colonias de las cuales fermentadoras de lactosa (tan solo de un
tipo=100% del mismo tipo) 6 (8´2%) y no fermentadoras 27 (81´8%). Los resultados del EMB nos dieron colonias brillantes pero no verdes por tanto solo tenemos Enterobacter aerogenes.
Por último, haremos lo mismo con las diluciones 10 -4^ y 10-5^ , pero esta vez en agar AVB, para ver las no fermentadoras que aquí serán rojas mientras que las fermentadoras no crecerán o serán amarillas. En este caso para determinar si son de Salmonella o Morganella se reinocularán colonias rojas en caldo de urea y en TSI, Salmonella aparecerá con precipitados negros en el TSI y urea negativo y Morganella a la viceversa, al realizar esta prueba nosotros determinamos que solo teníamos Salmonella typhimorium.
Conjugación bacteriana Ahora lo que vamos hacer es poner dos filtros de nitrocelulosa estériles en una placa de agar común , en los cuales pondremos una pequeña cantidad de dos cepas de E.Coli una de ellas con capacidad de transmitir un plásmido que da resistencia a kanamicina, encima pondremos Salmonella , una vez hecho este paso y después de incubar tomaremos los filtros y los meteremos en tubos que agitaremos y de los que tomaremos una pequeña cantidad que extenderemos en agar de McConkey con kanamicina para observa que se ha transmitido el plásmido y crecen colonias.
Tras todo esto calcularemos la frecuencia de transmisión del plásmido=Nºtransconjugntes/Nº iniciales (más o menos 10 9 en la muestra que nos dieron, pero en la cantidad que echamos había unas 10^7 ), y el resultado fue= 2´04x10 -3.
En la parte de transformación haremos algo parecido, pero con DNA, para ver cómo se pasa DNA entre bacterias gram negativas, después de realizar la centrifugación, el choque térmico, etc. Se extienden dos placas, una sin DNA(control negativo) y otra con el que tendrá el gen de resistencia al antibiótico, tras incubar observaremos las colonias
echaremos ampicilina, a otro estreptomicina y a otro los dos. Después realzar dos graficas una DO/T y otra PH/t. Estas gráficas irán en la página siguiente.
DO/PH T=0 45 90 135 180 1AB 0,149/6,1 0,234/5,93 0,482/5,59 0,872/5,31 0,989/5, 1CD 0,111/5,85 0,237/5,56 0,2/5,54 0,094/5,54 0/6, 2AB 0,148/6,18 0,295/5,94 0.407/5,61 0,418/5,47 0,456/5, 2CD 0.097/6,17 0,162/6 0,367/5,47 0,596/5.78 0,785/5, 3AB 0,087/5,99 0,230/5,55 0,361/5,45 0,253/5,56 0,098/5, 3CD 0,095/5,81 0,205/5,59 0,439/5,25 0,840/5,03 0,957/4,
-1CD a tiempo 45 min se le añade ampicilina.
-2AB a tiempo 45 min se le añade estreptomicina.
-3AB a tiempo 45 min se le añade estreptomicina y a tiempo 90 se le añade ampicilina.
