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Problemas BIOQUÍMICA (T4-‐6): Enzimología. 2012-‐
Instrucciones.
Las clases de los días 31 de octubre y 8 de noviembre serán realizadas como actividad con desdoble. Los subgrupos A la realizarán en el aula de teoría. Los subgrupos B en el aula de desdoble. Los diferentes equipos trabajarán de forma coordinada para resolver los problemas durante la celebración de las clases.
Las dudas serán resueltas por los diferentes grupos de trabajo, con el apoyo de los correspondientes profesores Cristina Murga ([email protected]), equipos A y Antonio Rodríguez ([email protected]) equipos B.
En ambas clases se realizarán sendos ejercicios de evaluación compuestos por problemas de similares contenidos y dificultad que los resueltos en las clases de preparación de problemas de enzimología. Se entregarán los problemas resueltos en equipo en la primera media hora y posteriormente se entregará una hoja con problemas resueltos de modo individual en los últimos 20 min.
CLASES DE PREPARACIÓN DE PROBLEMAS.-
1. Una reacción enzimática transcurre con cinética Michaeliana. La Km de la enzima
para el sustrato es de 10 -6^ M. Si la velocidad inicial para una [S] = 0,1 M es de 0,
μM/min, ¿cuál será el valor de la velocidad inicial a concentraciones de sustrato de
10 -6^ y 10-9^ M, respectivamente?
A partir de la ecuación de Michaelis y utilizando los datos del problema, podemos calcular el valor de Vmax
Vmax= Vo(Km + [S])/[S]
Sustituyendo:
Vmax= 0,1 μM/min (10 -6^ +0,1) M/0,1 M; luego Vmax = 0,1 μM / min
Entonces: Para [S] = 10 -6^ M ; v = 0,1 x 10 -6^ / (10 -6^ + 10 -6^ ) = 0,05 μM / min Para [S] = 10 -9^ M ; v= 0,1. 10 -9^ / (10 -6^ + 10 -9^ ) ≈ 0,1 x 10 -3^ μM / min
2. En el laboratorio donde trabajas se ha purificado la succinato deshidrogenasa (EC
1.3.99.1) de E.coli y la quieres comercializar (http://www.brenda-
enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.3.99.1). Para ello debes determinar experimentalmente
sus constantes cinéticas y por eso mides las velocidades de la transformación de
succinato a fumarato para diferentes concentraciones iniciales de sustrato (succinato).
Tus resultados son como sigue:
[succinato] 0 (M) 1/So
x10 5
Velocidad inicial
(nM/min)
1/vo (min/nM)
1 x 10 -5^1 16,0 0,
2,5 x 10 -5^ 0,4 30,8 0,
8 x 10 -5^ 0,13 53,4 0,
a) Determínese el valor de Km y el valor de Vmax.
b) Si la [E] de la enzima es de 0,04 nM, ¿Cuál será la constante catalítica (Kcat, k 2 ) de
esa enzima (expresar en las unidades adecuadas)?
c) ¿Qué significa esa Kcat? Defínelo en 2-3 frases.
d) Expresa la actividad enzimática en Unidades Internacionales (para ello necesitas el
volumen de reacción que es de 1mL).
a) Determinación gráfica mediante representación de inversos (o ajustando a una recta
con excel o similar)à Km≈ 4 x10-5^ M (40μM) Vm≈80 nM/min. (≈ significa que al
graficar estos datos “a mano” puede haber diferencias en los valores obtenidos: un
rango aceptable es de 1 orden de magnitud).
b) Vm=80 nM/min,, Kcat=Vm/Et = 80 nM/min /0,04 nMà Kcat= 2.000 min-^.
c) Que cada molécula de enzima catalizará la transformación de 2000 moléculas de
sustrato cada minuto.
d) Vm=80 nM/min= 80x10-3^ μmoles/Lt.min à 80x10-3^ μmoles/min x 10-3^ Lt/ml à
Vm(en U.I.)= 80x10-6^ UI
3. El nº de recambio (Kcat) de una enzima es 200 min-1^ y su peso molecular es 50.
Daltons (gr/mol).
a) Calcula la actividad de una preparación de dicha enzima asumiendo que está
completamente pura (es decir, su actividad específica).
b) ¿Cuál sería la Ae si la preparación tuviese una contaminación del 30% (p/p) por otras
proteínas? (Indicación: cada mg de vuestra preparación contiene un 30% de impurezas)
c) Explica la diferencia entre ambos resultados y discute su repercusión para la posible
utilización de ese enzima en un laboratorio.
a) De la definición de Kcat (mol de S transformado por min por mol de Ez) se deduce que , si Kcat es 200min -1^ , serán 200 los mol de S /( min x mol de Enzima)=200 μmol de S/(min x μmol de Enzima) Como 1 μmol de Enzima equivale a 50.000 μg=50mg, la actividad específica será: Act. Específica = 200 μmol / ( min x 50 mg) = 4 U/mg
b) Para obtener 1 μmol de Enzima tendrías que pesar 50mg + (50 x 0,3) mg= 65mg, la actividad específica será: Act. Específica = 200 μmol /(min x 65 mg) = 3 U/mg
a) Determinación gráfica mediante representación de inversos (o ajustando a una recta
con excel o similar)à Km≈ 10 μM y Vm≈ 45,45 μM/min. (≈ significa que al graficar
estos datos “a mano” puede haber diferencias en los valores obtenidos: un rango
aceptable es de 1 orden de magnitud).
b) Competitivo
c) Para calcular el valor de Ki necesitamos la Km aparente (Km en presencia del inhibidor)à -1/Km app^ = -0,033,, Km app^ = 30,3 μM. Km app^ = Km x (1 + [I]/Ki),, Ki= (Km x [I])/ (Kmap-Km),, Ki= 49,2 μM. Una Ki≈ 50 μM Indica que la afinidad del ©Bajotensil por el enzima ACE está en el rango μM, y que a una [I] de 50μM LA MITAD del ACE estará unido a ©Bajotensil y la otra mitad no.
d)Dado que el inhibidor es competitivo, una Ki≈μM (indica que la afinidad del I por el
Ez requiere unas [I] de μM) no suele ser suficiente como para competir de manera
eficaz con la [S] (probablemente similar a la que indica la Km del enzima, 10μM). Si se
quisiera analizar su utilidad como fármaco, se deberían conseguir Ki en el rango de nM
o más bajas (>1000 veces más afines que el S a la hora de unirse al Ez). Eso se puede
conseguir mediante modificaciones químicas de la molécula inhibidora que consigan
optimizar las interacciones del inhibidor con el dominio de interacción con el sustrato
del Ez. Se recomiendan Ki del orden de nM para que el esfuerzo económico y
experimental que supone validar estos datos en animales tenga más probabilidades de
éxito.
5. Calcular el valor de Ki de un inhibidor competitivo según la siguiente información:
Km = 6,7 x 10 -4^ M.
Vmax (sin inhibidor) = 300 micromoles/litro x min.
Vi (en presencia de [I] =10-5^ M) = 1,5 μM/min, para [S] = 2 x 10-5^ M.
Aplicando la ecuación:
[S] x Vmax Vi= Km x (1 + [I]/Ki) + [S]
Km aparente
Despejando la Km aparente y sustituyendo cada parámetro por los datos proporcionados
[S] Vmax [S] 2 x 10 -5^ M x 300 umol/litro x min Km aparente = - 2 x 10 -5^ M 1,5 umol/litro x min
Vi
Km aparente = 0,00398 M
Finalmente, y para calcular Ki
Km x (1 + [I]/Ki) = 0,00398 M
6,7 10 -4^ M (1 + 10 -5^ M/Ki) = 0,00398 M
(1 + 10 -5^ M/Ki) = 5,
Ki = 10 -5^ M / 4,94 = 2 x 10-6^ M
Ki= 2 x 10 -6^ M
6. Si la Km de una enzima para su sustrato es 10 -5^ M y la Ki para un inhibidor
competitivo es 10-6^ M, ¿qué concentración de inhibidor será necesaria para disminuir la
velocidad de reacción en un factor de 10, cuando la [S] sea 0,1 M?
Llamaremos v’ a la velocidad en presencia de inhibidor, y v a la velocidad en ausencia del mismo. El problema nos dice que: v’ = v/10.
Por otro lado, V’= Vmax [S]/Km (1+[I]/Ki)+ [S] y V= Vmax [S]/Km+ [S]
Luego Vmax [S]/Km (1+[I]/Ki)+ [S]= Vmax [S]/10 x (Km+ [S])
Despejando: 10 x (Km + [S])= Km (1 +[I]/Ki) + [S]
Si [S] = 0,1 M, tendremos:
10 (10 -5^ + 0,1) = 10 -5^ (1 + [I]/10 -6^ ) + 0, 10 -4^ + 1 = 10 -5^ + 10 [I] + 0,
[I] = 0,09 M
PROBLEMAS DE MAYOR DIFICULTAD:
7. El pirofosfato se hidroliza por la acción de la pirofosfatasa. La enzima de B. subtilis
tiene una masa molecular de 120 kiloDaltons (kD, siendo 1 Dalton=1gr/mol). Para esta
enzima se define la unidad de actividad enzimática como “la cantidad de enzima que
Para calcular la concentración de enzima total en el ensayo, sabemos que la preparación contiene 0,2 mg /ml y de esos 0,2 mg sólo el 70% son de enzima, luego en la concentración de enzima en la preparación es de:
0,2 x 0,7 = 0,14 mg de enzima /ml
Simplemente, transformando mg en micromoles:
1 mol de enzima equivale a 70.000 gr, por lo que 1 μmol equivaldrá a 70 mg, y 0,14 mg de enzima se corresponden con 0,002 μmoles.
Por lo tanto, la concentración de enzima en el ensayo es de 0,002 μmol x ml -
Luego:
Kcat = 5 umol x min -1^ x ml -1^ / 0,002 μmol x ml -1^ ;
Kcat= 2500 min
HOJA DE AYUDA BLOQUE ENZIMOLOGÍA
Unidad Internacional de actividad enzimática: cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol de sustrato por minuto en condiciones óptimas de disponibilidad de sustrato (SATURACION) pH y Tª para ese enzima (condiciones de “velocidad máxima”).
La actividad enzimática es la V (^) max (v en condiciones de saturación) expresada en micromoles de S transformados por min. (en lugar de [S] transformado/min) por micromol de enzima..
Vm (Uds. de ACTIVIDAD ENZIMATICA/Lt) = Kcat (en min -1^ ) x [Et] (en micromoles/Lt).
Actividad específica: Es la cantidad relativa de enzima respecto al total de proteína de una preparación y se expresa como U/mg de proteína.
Ecuación de Michaelis-Menten:
Vm[S] v (^) o = ------------- Km + [S]
Constante de Michaelis-Menten:
Para una reacción:
k 1 k (^2) E + S ⇐⇒ ES → E + P k (^) -
k (^) -1 +k (^2) se define que Km = ------------- k (^1)
