Protocolo No.2 Materiales y tecnicas, Ejercicios de Biología Molecular

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i PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA PROTOCOLO No. 2 Materiales y Técnicas del Laboratorio de Fuente. https://image.shutterstock.com/image-photo/chemistry-class-makes-experiment-stem- 260nw-1034690101.jpg Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA 1. Introducción Materiales de laboratorio Parte del éxito del trabajo en el laboratorio, radica en la capacidad de observación del experimentador y el uso adecuado del material de laboratorio. A continuación, se identifica y describe el material de uso común en el laboratorio, para una mejor descripción del mismo se clasificará según su naturaleza en: material de vidrio, material de porcelana, material de metal y otros — material de plástico y madera- (UNIVERSIDAD DE ZULIA, 2016). Material de vidrio En material de vidrio es fabricado de boro silicato con baja concentración de alcalino térreos y libre de metales pesados, lo que le confiere una gran resistencia a la acción de agentes físicos y químicos. Algunas de las marcas más usadas pueden contener un 96% de silicato. También se clasifican en: de vidrio transparente, vidrio esmerilado y vidrio rojo o ámbar. Lámina porta objetos: es una lámina de vidrio rectangular de color transparente utilizada para almacenar muestras y objetos con el fin de observarlas bajo el microscopio. Generalmente de 75 por 26 mm de aproximadamente 1 mm de grosor, que se usa para sostener objetos para examinarlos con un microscopio. Normalmente, el objeto se monta (asegura) en el portaobjetos y luego ambos se insertan juntos en el microscopio para su visualización. Lámina cubre objetos: un cubreobjetos es una fina hoja de material transparente de planta cuadrada. Se coloca sobre un objeto que va a ser observado bajo microscopio, el cual se suele encontrar sobre un portaobjetos. Tubo de ensayo: tiene forma cilíndrica alargada y cerrado por uno de sus extremos tubo de diferente tamaño y diámetro, el más común es de 150 X 16 mm. Se usa para calentar, y efectuar reacciones con pequeñas cantidades de reactivos. Desecador: es un recipiente de vidrio con dos compartimientos separados por una placa Caja de Petri: la placa o caja de Petri es un instrumento de laboratorio que consta de una base circular y sus paredes son de una altura baja, aproximadamente de un cm. Miden unos 10 cm de diámetro, aunque esta longitud puede variar. Posee una cubierta de la misma forma, pero algo más grande de diámetro, para que se pueda colocar encima y cerrar el recipiente, aunque no de forma hermética, para proteger el cultivo de agentes externos que lo podrían contaminar. Se pueden reutilizar después de haber sido descontaminadas y esterilizadas. El uso más común de estos instrumentos es el de ser contenedores para el cultivo de células, bacterias y mohos. Como las cajas de Petri se hacen en materiales transparentes se pueden observar diferentes tipos de muestras biológicas. De este modo, se puede llevar un registro del progreso sin necesidad de abrirla. Agitador- policía o guía: varilla de vidrio de extremos romos, se usa para remover o mezclar sustancias y también sirve para la transferencia de líquidos. Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Pipeta volumétrica: que consiste en un tubo abierto por ambos extremos terminado en punta con un ensanchamiento o bulbo en su parte central, en la parte superior de succión hay una línea llamada aforo que señala hasta donde debe llenarse la pipeta para contener el volumen indicado, también tiene una banda coloreada que varía de acuerdo a la capacidad de la pipeta. La pipeta volumétrica se usa para hacer mediciones exactas de muestras no viscosas. Cilindro graduado o probeta: es de diámetro uniforme con paredes gruesas, fondo plano y provisto de una base para su mayor estabilidad, presenta graduaciones a lo largo del tubo y en su parte superior posee un pico y puede estar provisto de una tapa. Se fabrica en diferentes capacidades, desde 10 mililitros a varios litros. La probeta se usa para medir líquidos cuando no es necesaria una gran exactitud. Gotero o cuenta gotas: Tubo corto para añadir gota a gota. usa para preparar soluciones de concentración conocida. Pipeta graduada: consiste en un tubo cilíndrico graduado uniformemente a todo lo largo y terminado en punta por su extremo inferior, algunas de estas pipetas tienen sus graduaciones desde el aforo hasta la punta y reciben el nombre de “pipeta graduada serológica”. Otras de estas pipetas tienen sus graduaciones comprendidas entre dos aforos y reciben el nombre de “pipeta graduada de Mohr” las pipetas mencionadas existen en diferentes capacidades y se pueden identificar fácilmente por la banda coloreada, estas pipetas se usan para medir reactivos y no son suficientemente exactas para medir muestras o estándares. Pipeta Pasteur: es una pipeta volumétrica se usa para medir la alícuota de un líquido con bastante precisión. Las pipetas poseen escalas en ml a través del tubo, lo cual se hace visible debido a la transparencia del mismo permitiendo observar el líquido y la escala indicando distintos volúmenes. Fuente. UNIVERSIDAD DE ZULIA, 2016 Material de porcelana Este material es fabricado de una arcilla compuesta de caolín, cuarzo y feldespato, de la proporción y pureza de estos materiales depende la resistencia química, física y mecánica de la porcelana. Cápsula de porcelana: un recipiente poco profundo de paredes delgadas y con un pico en su borde, sirve para evaporar sustancias mediante calentamiento directo o indirecto. Crisol: es un recipiente con forma de cono truncado de paredes delgadas y con una tapa, se emplea para calentar y calcinar sustancias a elevadas temperaturas. Triángulo de porcelana: Tiene forma triangular, recubierto con material de arcilla, Embudo Buchner: es de forma cónica en su parte superior y en la parte inferior presenta una prolongación cilíndrica, en su interior posee una placa porosa. Puede ser de diferentes tamaños. Se usa para hacer filtraciones al vacío. Mortero: es un recipiente de paredes gruesas y poco profundo en su borde posee un pico y se complementa con un mazo, se usa para triturar o pulverizar sustancias. Espátula de porcelana: utensilio de forma alargada Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA se usa para sostener el crisol durante el calentamiento. Material de metal Constituido de elementos como el hierro, uso. Asa bacteriológica: asa de platino o también llamada asa de Kolle, es un instrumento de laboratorio que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina o en un arito de 5 mm “ asa curva” o en punta “asa recta”. Se emplea para transportar, arrastrar, trasvasar ¡nóculos (pequeño volumen que contiene microorganismos en suspensión). La cantidad de inóculo que se trasvasa viene determinada por el diámetro del aro final del filamento, que se encuentra calibrado y normalmente oscila entre 0,01 y 0,001 ml. Bisturí: también llamado escalpelo, lanceta o cuchillo de cirujano, es un instrumento en forma de cuchillo pequeño, de hoja fina, puntiaguda, de uno o dos cortes, que se usa en procedimientos de disecciones anatómicas y cortes de material vegetal entre otros. Aguja de disección: de punta fina con mango metálico. Fabricada en acero inoxidable, puede tener forma curva o recta. Las agujas de disección se utilizan para sujetar tejidos o pequeñas estructuras durante un breve período de tiempo. Soporte universal: formado por una varilla que se enrosca en una base rectangular y plana, se usa como soporte para fijar y armar montajes en el laboratorio. Aro metálico: está provisto de un tornillo que le permite sujetarse al soporte universal, se usa para sostener la rejilla, el embudo de decantación y el embudo de filtración entre otros. en el centro y en sus extremos tienen forma rectangular y plana, se utiliza para transferir sólidos. níquel, plata, platino y otros dependiendo de su Rejilla: construida con una malla metálica, tiene en su centro un área circular de amianto para dispersar el calor, se usa para evitar el calentamiento directo Trípode: está formado por un aro en donde se enroscan tres varillas que lo soportan se utiliza para sostener la rejilla metálica y el triángulo de arcilla. Pinza para soporte universal: un utensilio con un tornillo en uno de sus extremos que sirve para sujetarla al soporte universal, en el otro extremo posee dos salientes recubiertos de goma provistos de un tornillo que le permite ajustar el material que va a sostener. También se le conoce como “pinza nuez” y hay variante doble nuez. Pinza para bureta: presenta en su parte central un tornillo que sirve para sujetarla al soporte universal, y en sus extremos presenta unas adaptaciones recubiertas de goma que le permiten sujetar con seguridad la bureta. Pinza para crisol: instumento de metal, su forma está especialmente diseñada para manipular el crisol. Pinza para tubo de ensayo: instrumento de metal, diseñada especialmente para sostener dicho tubo. Pinza de presión: en esta categoría están las pinzas de Mohr y la pinza de Hoffman que se usan para impedir la salida de fluidos a través de un tubo de goma. Mechero Bunsen: consta de un tubo vertical que en su parte inferior presenta unos orificios llamados ventanas que regulan la entrada y salida del aire, este tubo esta enroscado a una base en la que se encuentra una llave para regular la entrada de gas, y un tubo lateral, en donde se conecta la manguera que lo une a la fuente de gas. El mechero se usa para calentar. Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Hay diferentes técnicas que se emplean en biología celular para conocer la estructura y función de las células, figura 1. Lógicamente, no es el objetivo de este protocolo hacer una exposición exhaustiva de todas ellas y explicar su metodología. Es de interés, en este caso, destacar las principales herramientas utilizadas para el estudio más rutinario de las células. En particular, el objeto de estudio central son las técnicas relacionadas con la microscopía. Algunas otras técnicas más propias de la biología molecular o la bioquímica con interés diagnóstico serán analizadas en el transcurso de asignaturas posteriores (Calvo, 2015). Figura 1. Técnicas de estudio de las células y tejidos. Métodos de estudio; Células y tejidos ] Métodos Ténicas Métodos citológicos instrumentales citoquímicos T A Dscón de] | ¿doqumica | [Microscopio | | Coloración | [Fraccionamiento Tiposds microscopios | Ténicas ] [Uiización de Inmunohístoquimica AN Soloracié A fuorescencia m 50] Pecos [Bel] | opens | tetctorices tod 7 a [oro] jus De banido Uiracertifugación alos anéliica ve Detansmisión Prozadrmior1] pesto Fuente. El autor. Técnica histológica: se denomina al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios ópticos y electrónicos (Calvo, 2015). Procedimientos inmediatos o vitales. Permiten el estudio de protozoarios, células sanguíneas, células descamadas o disociadas, células en cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y translúcidas como la membrana peritoneal de animales pequeños o epidermis de vegetales, granos de polen, suspendidas en los líquidos de su hábitat natural o solución salina balanceada. Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubrirla, sin formar burbujas de aire, con un cubreobjeto. En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloración vital, esta puede ser de dos tipos: Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Coloración intravital: consiste en la administración de colorantes vitales a través de las vías digestiva o intratraqueal; mediante inyecciones sanguíneas, linfáticas, subcutánea, o intraperitoneal. Las soluciones de uso más frecuente son: tinta china, carmín de litio, azul tripan (partículas colorantes que demuestran la capacidad fagocítica) (Calvo, 2015). Coloración supravital: en este procedimiento se emplean colorantes que se aplican a células o tejidos provenientes de organismos vivos. Se demuestran: mitocondrias con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresyl, ramificaciones nerviosas con el azul de metileno; o el ADN y el ARN de las células con naranja de acridina (empleando el microscopio de fluorescencia) (Calvo, 2015). Procedimientos mediatos o postvitales. Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en los que los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían en vida (Calvo, 2015). De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar una secuencia de pasos, a continuación, se explican dos técnicas: Técnica 1 1. Obtención de la muestra: segmento de tejido animal (biopsia) o vegetal. 2. Fijación: se sumerge en una solución fijadora, preferentemente formol al 10% borato (puede seleccionarse fijadores específicos como Bouin según el tipo de tejido). Puede realizarse aclaramiento o ablandamiento si el tejido lo requiere. 3. Deshidratación: se procede a someterse a un gradiente de alcoholes de concentración creciente. 4. Inclusión: se “incluye” en parafina analítica, se forma el taco que permita realizar el corte. 5. Corte: se realiza con micrótomo los cortes con la orientación y el espesor deseado (1 a 60 micras) en series. 6. Obtención del corte: se obtiene o “pesca” el corte histológico en la lámina porta objeto se fija (en este caso se adhiere). 7. Hidratación: se procede a someterse a un gradiente de alcoholes de concentración decreciente. 8. Tinción: se aplica técnica general de Hematoxilina y Eosina (HyE) o tinción diferencial según sea el propósito. 9. Deshidratación: de ser necesario se deshidrata y se lleva a un montaje de medio permanente para preservar la muestra. 10. Microscopio: se lleva a observación. Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Tinción de muestras: la mayoría de los colorantes se comportan como bases o como ácidos, en los colorantes básicos, los cromóforos o grupos químicos responsables del color, son catiónicos, estos se combinan con los grupos ácidos (aniónicos) de las moléculas celulares. Por esta razón, los ácidos nucleicos son basófilos, es decir presentan afinidad por colorantes básicos cuyos radicales se unen a los radicales ácidos del ADN y del ARN. El azul de Toluidina, el azul de metileno y la hematoxilina son ejemplos de colorantes básicos. En los colorantes ácidos, los cromóforos son aniónicos (carga eléctrica negativa) y tienden a unirse con los componentes celulares de carácter básico, que son eléctricamente positivos. Así las estructuras celulares ricas en grupos básicos son acidófilas por su afinidad con los colorantes ácidos. La eosina, el orange G y la fuscina, son ejemplos de colorantes ácidos. Entre los diferentes tipos de tinción están: Tinción negativa: los colorantes no tiñen el microorganismo sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota de colorante (nigrosina, tinta china). Tinción simple: se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células. Tinción diferencial: intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura. El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero, denominándose colorante de contraste. Al tincionar se debe identificar la naturaleza química de la muestra biológica y tener presente el fenómeno de metacromasia. Cultivo de tejidos: El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas, pueden cultivarse en condiciones controladas. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los péptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos. Aplicaciones del cultivo celular. Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenómeno celular. Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA a. Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej. transcripción de ADN, síntesis de proteínas, metabolismo energético. b. Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos, como por ej. ensamblaje y des ensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del ARN: núcleo-citoplasma, movimiento de proteínas. c. Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciación., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformación celular (inducidas por virus o agentes químicos), cinética de la población celular. d. Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula. Como ejemplo de áreas de investigación fuertemente dependientes de las técnicas de cultivo celular se encuentran: 1. Virología: Establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, producción de vacunas antivirales. 2. Investigación del Cáncer 3. Inmunología: Gracias especialmente a la introducción de las técnicas de fusión celular en la producción de anticuerpos monoclonales, así como en el análisis de la genética de la célula somática. 4. Ingeniería de proteínas. Por la producción de proteínas en líneas celulares: interferón, insulina, hormona de crecimiento. Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Gl 2.2.1 Actividades preliminares A partir de medio repollo morado cortado en trozos (retirar el tallo blanco), cocinarlo muy bien en medio litro de agua, dejarlo enfriar y colarlo reservar este zumo en una botella plástica para el proceso de experimentación. 2.2.2 De acuerdo a la introducción realizada en la clase, organizar los materiales vistos en una tabla con las siguientes características: Tipo de material y función. 2.2.3 Teniendo en cuenta la siguiente sopa de letras, encontrar palabras relacionadas con el laboratorio del día AI|N|T|O|C|I [A[N|I |[N|A|S|JO|P|A|G S|Q|W|E|R|JA|T|Y|U|I JO|V|Z |! |[S|R AJA|JY|U|I JE[J|E|S|X|R|!I [X|[P|D|A R|S|K|I |[¡S|IR|JA|AJQ|C|T|D|C|E|F|D E|D|L|O|JO|T|S|P|P|V|Y|R|V|T|G|I C|F|N]PIL[Y|D[Ñ]A[EJU|I [B[A[H|L T|G|Q|AJA|H|F|L|Z|B|T|O|N|G]|J|L A|HJE|R|[L|JE/|N|M|E|Y|E|R|M|[R|K|A Q|P|W|S|S|F|G|K|X|S|I [E|I [A[L|Z B| [clA|RI]BTO[|N|A[|T]O|L|Q|D|ÑT|X W|P|JE|D|XJU|H|M|C|!I! |P|JO|JEJUJO|C EJE|R|F|C|F|J|N|E[N|A/J|AJA|P|V R|T|T|G|TJO|K|B|R|C|S|Z|S|D]|U|B T|A[Y|H[R|D|L|U|T|I [D|X|FJAJI |N M[A|S|M|E|C|H|E|R|O|F|C|T|! [Y |M NIB]vic]x]z]|Ñ]|! juijn]jc¡vjujol[v]E Eg PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Gl 2.2.4 Prueba de pH + Marcar 5 tubos de ensayo con las sustancias que aparecen debajo de los dibujos. e Llenarlos hasta la mitad con cada una de las soluciones con las que fueron marcados y agregar 12 gotas de la solución de repollo morado. + Observe sus resultados y consígnelos de la siguiente manera: Agua Agua Jugo de limón Alcohol Vinagre + Bicarbonato ojugo de naranja de Sodio 2.2.5 Con sus compañeros identifique cada uno de los materiales de laboratorio que se encuentra en el cuadro adjunto. Revise el enlace materiales de laboratorio: https://www.youtube.com/watch?v=Pc53DrchQYMAlistsUUEXC5Y- 6vXI2CCcRIHNsCnkg8index=5. PROGRAMA DE BIOLOGIA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA Calvo, A. (2015). Biología celular biomédica. Elsevier. Disponible en: http://up- rid2.up.ac.pa:8080/xmlui/handle/123456789/1784 Webgrafía http://chemcollective.org/activities/vlab?file=assignments/Default_es.xml8lang=es,. http://almez.pntic.mec.es/-¡rem0000/dpbg/mat-lab/material-lab.htm Webgrafía imágenes https: //www.lancetahg.com.mx/10903-thickbox_default/porta-objetos-de-vidrio-50- piezas.jpg https://kitlab.exa.unicen.edu.ar/cubreobjetos-de-vidrio-de-18-x-18-mm-para- microscopio.jpg https://www.3bscientific.com/imagelibrary/W16178/W16178_01 Petri-Dishes- 55x15-mm.jpg https://static.praxisdienst.com/out/pictures/generated/product/1/1500_1500 100/13 5590 91 reagenzglaeser 1.ipg https://m.media-amazon.com/images/l/41Lpm82noWL.jpg https://images-na.ssl-images-amazon.com/images/l/61Gbc9wpoHL. 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