Pobierz biologia.pdf i więcej Ćwiczenia w PDF z Biologia tylko na Docsity!
NOTATKI DO CZ E↪SCI BIOLOGICZNEJ´
Jerzy Tiuryn
Instytut Informatyki
- rok akademicki 2005/ Uniwersytet Warszawski - 8 listopada
- 1 Kwasy nukleinowe Spis tre´sci
- 1.1 DNA
- 1.2 RNA
- 1.3 Centralny dogmat biologii molekularnej
- 2 Zasady syntezy kwas´ow nukleinowych
- 3 Trzy kr´olestwa
- 3.1 Prokaryota
- 3.2 Eukaryota
- 3.3 Archea
- 4 Transkrypcja gen´ow prokariotycznych
- 5 Transkrypcja gen´ow eukariotycznych
- 6 Bialka
- 7 Kod genetyczny
- 8 Translacja
- 9 Geny, chromosomy, genomy
- 9.1 Co to jest gen?
- 9.2 Chromosom
- 9.3 Genomy
- 9.4 Historia poznawania sekwencji genom´ow
- 9.5 Projekt poznania genomu czlowieka (Human Genome Project)
- 10 Pewne metody rekombinacji DNA
- 10.1 Klonowanie
- 10.1.1 Enzymy restrykcyjne
- 10.1.2 Wektory plazmidowe
- 10.1.3 Komplementarne DNA (cDNA)
- 10.1.4 Wektory λ-fag´ow
- 10.1.5 Biblioteki genomowe
- 10.1.6 Inne wektory
- 10.2 Metody sekwencjonowania
- 10.2.1 Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (1977)
- 10.2.2 Metoda enzymatyczna Sangera (1977)
- 10.3 Technika PCR
- A — T (slabsze wi azanie).↪
- G —- C (silniejsze wi azanie).↪
Mo˙zliwe s a wyj↪ atki, np. G — T.↪ Ksztalt: mo˙ze by´c ni´c (podw´ojna) lub cykl. Rozmiary: zasady s a oddalone od siebie o 0.34 nm (licz↪ ac wzdlu˙↪ z osi). Pelny obr´ot co 3.4 nm. Denaturacja DNA – rozpl atanie nici pod wplywem wysokiej temperatury↪ (zwykle 80-90C, zale˙znie od kwa´sno´sci ´srodowiska i skladu nukleotyd´ow). Slabsze wi azania rozpadaj↪ a si↪ e szybciej. Po obni˙↪ zeniu temperatury nast epuje↪ ponowne l aczenie w helis↪ e (↪ renaturacja).
1.2 RNA
Budowa chemiczna podobna do DNA, zamiast tyminy (T) jest uracyl (U). Jest hipoteza, ˙ze RNA pojawilo si e na ´↪ swiecie przed DNA. RNA jest mniej stabilne ni˙z DNA (np. rozpada si e w alkalicznych roztworach).↪ Podobnie jak DNA, tworzy pojedyncze nici, podw´ojne, liniowe lub cykliczne. Wa˙zna jest tr´ojwymiarowa struktura RNA (wla´sciwo´sci katalityczne lub l aczenie si↪ e↪ z bialkami).
1.3 Centralny dogmat biologii molekularnej
DNA −→ RNA −→ bialko
- Przej´scie od DNA do RNA – transkrypcja.
- Przej´scie od RNA do bialka – translacja.
- Bialka bior a udzial w wielu procesach (jako enzymy, skladniki budul-↪ cowe, regulatory innych proces´ow).
Geny – minimalne fragmenty nici DNA zawieraj ace informacj↪ e odpowiedzialn↪ a↪ za dzialanie ka˙zdej niezale˙znej funkcji w organizmie.
2 Zasady syntezy kwas´ow nukleinowych
- Zar´owno DNA jak i RNA s a produkowane przez kopiowanie istniej↪ acej↪ wcze´sniej nici DNA (zgodnie z zasad a komplementarno´↪ sci Watsona- Cricka).
- Kierunek kopiowania jest zawsze od 5’ do 3’ (tzn. powstaj aca ni´↪ c jest budowana w kierunku od 5’ do 3’).
- Przy kopiowaniu bior a udzial specjalne enzymy, nazywane↪ polimer- azami. DNA polimerazy slu˙z a do budowania DNA, a↪ RNA polimerazy slu˙z a do budowania RNA. Budowa RNA na podstawie matrycy DNA↪ nazywa si e↪ transkrypcj a↪. RNA polimerazy mog a zacz↪ a´↪c budow e nowej↪ nici (de novo). Natomiast DNA polimerazy nie mog a – musz↪ a zaczyna´↪ c od pewnego miejsca zwanego starterem lub primerem i doklejaj a now↪ a↪ ni´c z nukleotyd´ow. Rysunek: transkrypcja DNA na RNA (4-20,L).
- Synteza podw´ojnego DNA (replikacja) przebiega poprzez mechanizm zwany widelkami replikacyjnymi. Synteza wzdlu˙z jednej nici (ni´c prowadz aca,↪ leading strand) odbywa si e w spos´↪ ob ci agly. Synteza wzdlu˙↪ z drugiej nici (ni´c op´o´zniaj aca, lagging strand↪ ) odbywa si e kawalkami (zawsze od 5’↪ do 3’) zwanymi fragmentami Okazaki. Rysunek: schemat replikacji (4-22,L).
3 Trzy kr´olestwa
3.1 Prokaryota
Organizmy, kt´orych kom´orki nie zawieraj a j↪ adra, np. bakterie. (↪ To nie jest pelna definicja!).
3.2 Eukaryota
Organizmy, kt´orych kom´orki zawieraj a j↪ adro (np.↪ dro˙zd˙ze, nicie´n, muszka owocowa, czlowiek).
3.3 Archea
Bakterie ˙zyj ace w ekstremalnych warunkach (temperatura, ci´↪ snienie), np. na dnach ocean´ow. Nie maj a j↪ adra, ale pod pewnymi wzgl↪ edami (np. istnienie↪ ekson´ow/intron´ow) przypominaj a Eukarioty.↪
4 Transkrypcja gen´ow prokariotycznych
Geny odpowiedzialne za jeden cel metaboliczny (np. synteza jakiego´s aminok- wasu) le˙z a obok siebie (na chromosomie) i ich transkrypcja jest ws´↪ olnie regu- lowana. Taki fragment nazywa si e↪ operonem. Transkrypcja przebiega wedlug
7 Kod genetyczny
Ka˙zdemu aminokwasowi odpowiada sekwencja trzech nukleotyd´ow (kodon), kt´ora go koduje. Cz esto wi↪ ecej ni˙↪ z jedna sekwencja koduje ten sam aminok- was, np. leucyna ma 6 kodon´ow. tablice kodon´ow: (4-3,L), (4-4,L). Kodon AUG (metionina) koduje pocz atek polipeptydu. S↪ a trzy kodony↪ stopu (nie koduj a ˙↪zadnego aminokwasu): UAA, UGA, UAG. Tak wi ec l↪ acznie↪ 61 kodon´ow reprezentuje 20 aminokwas´ow. Ci ag nukleotyd´↪ ow (RNA) wyznacza pewien ci ag aminokwas´↪ ow. W zale˙zno´sci gdzie zaczniemy czyta´c, mo˙zemy dosta´c trzy r´o˙zne ci agi aminokwas´↪ ow. Ramka odczytu to ci ag nukletyd´↪ ow nie przerwany kodonem stopu.
8 Translacja
Jest to proces przetwarzania zakodowanej (przy pomocy kodon´ow) informacji w mRNA na bialko. Jest to bardzo skomplikowany proces, w kt´orym bior a↪ udzial nast epuj↪ ace kwasy rybonukleinowe:↪
- mRNA, informacyjne RNA, zawiera zakodowan a informacj↪ e o bialku.↪
- tRNA, transportuj acy RNA↪ (ang. transfer RNA). Dlugo´sc”: 70-90 nuk- leotyd´ow. Ustala odpowiednio´s´c pomi edzy aminokwasem i kodonem.↪ L aczenie ‘pustego’ tRNA z odpowiadaj↪ acym aminokwasem jest regu-↪ lowane przez enzym. Powy˙zsza odpowiednio´s´c jest osi agni↪ eta poprzez↪ tzw. antykodon czyli kodon komplementarny. S a r´↪ o˙zne tRNA dla r´o˙znych aminokwas´ow. Bakterie maj a okolo 30-40 r´↪ o˙znych rodzaj´ow tRNA, a zwierz eta i ro´↪ sliny okolo 50. Rysunek: schemat tRNA (4-31(a),L).
- rRNA (rybosomowe RNA). Rybosomy s a kompleksami skladaj↪ acymi si↪ e↪ z wielu podjednostek bialkowych i rRNA. Przeprowadzaj a one wla´↪ sciw a↪ syntez e bialek.↪
8.1 Proces translacji
- (Faza inicjacji) tRNA nios acy metionin↪ e, wraz z innymi bialkami (in-↪ icjuj acymi) i z mniejsz↪ a cz↪ e´↪sci a rybosomu (rybosom sklada si↪ e z dw´↪ och nier´ownych cz e´↪sci) l acz↪ a si↪ e z mRNA w pozycji start (AUG). W´↪ owczas dol acza si↪ e wi↪ eksza cz↪ e´↪s´c rybosomu. Rysunek: faza inicjacji (4-42(a),L).
- (Faza wydlu˙zania) Zostaje pobrany nast epny tRNA, kt´↪ orego antykodon pasuje do kolejnego kodonu w ci agu mRNA. Polipeptyd wyprodukowany↪ dot ad ‘wisi’ przy poprzednim tRNA. Nowy aminokwas zostaje dol↪ aczony↪ do polipeptydu (na ko´ncu karboksylowym) i wi ekszy polipeptyd ‘wisi’↪ teraz przy ostatnim tRNA. Poprzednie tRNA (puste) zostaje wydalone z rybosomu. Wydlu˙zanie polipeptydu jest przeprowadzane od ko´nca aminowego (N) w kierunku ko´nca karboksylowego (C). Nast epnie ry-↪ bosom przesuwa si e o kolejne trzy pozycje wzdlu˙↪ z mRNA ( w kierunku od 5’ do 3’).
- (Terminacja) Po napotkaniu przez rybosom kodonu stopu nast epuje↪ uwolnienie zbudowanego polipeptydu, uwolnienie ostatniego pustego tRNA i odl aczenie rybosomu od mRNA. Rysunek: schemat fazy wydlu˙↪ zania i terminacji (4-42(b,c),L).
Kilka rybosom´ow (po kolei) mo˙ze pracowa´c w tym samym czasie na jed- nym mRNA. Pr edko´↪ s´c budowania polipeptydu przez rybosom to 3-5 aminok- was´ow na sekund e. Zatem bialko o 100-200 aminokwasach jest produkowane↪ przez ok. 1 minut e.↪ Du˙ze bialka (np. titina, 30 000 aminokwas´ow) s a bu-↪ dowane przez 2-3 godziny.
9 Geny, chromosomy, genomy
9.1 Co to jest gen?
Jest to taki fragment ci agu nukleotyd´↪ ow DNA, kt´ory jest niezb edny do↪ syntezy funkcjonalnego polipeptydu lub cz asteczki RNA. Tak wi↪ ec, opr´↪ ocz niezb ednej informacji koduj↪ acej ci↪ ag aminokwas´↪ ow w bialku lub funcjonalne RNA (takie jak tRNA lub rRNA) geny zawieraj a jeszcze inne ci↪ agi nukleo-↪ tyd´ow DNA, kt´ore s a niezb↪ edne do przeprowadzenia transkrypcji. Takie ci↪ agi↪ mog a le˙↪ ze´c daleko (50 kbp lub wi ecej) od regionu koduj↪ acego.↪
9.2 Chromosom
Jest to cz asteczka DNA zawarta w kom´↪ orce (sp´ojny kawalek). Otaczaj a↪ t e cz↪ asteczk↪ e bialka odpowiedzialne za ekspresj↪ e gen´↪ ow. Liczba r´o˙znych chromosom´ow (oraz ich wielko´s´c) s a specyficzne dla ka˙↪ zdego gatunku. U prokariota jest jeden chromosom (jest on zwykle cykliczn a cz↪ asteczk↪ a DNA).↪ U eukariota jest wiele chromosom´ow. Zawarte s a one w j↪ adrach kom´↪ orek. Chromosomy eukariota s a liniowymi podw´↪ ojnymi ni´cmi DNA.
jaka jest rola tej cz e´↪sci DNA.
9.4 Historia poznawania sekwencji genom´ow
Obecnie (listopad 2005) zsekwencjonowanych jest ponad 180 genom´ow r´o˙znych organizm´ow. Poni˙zej przedstawiam chronogi e najwa”zniejszych wydarze´↪ n zwi azanych z projektami sekwencjonowania.↪
- Bakteriofag φX174 (5,4 kbp) – pierwszy calkowicie zsekwencjonowany w calo´sci material genetyczny (Sanger, 1972).
- Fag λ (48,5 kbp), Sanger 1982.
- Bakteria Haemophilus influenze (1 830 kbp), Venter 1995.
- Bakteria Mycoplasma genitalium (580 kbp), Venter 1995.
- Dro´zd´ze piekarskie Saccharomyces cerevisiae (13 500 kbp) – pierwszy genom eukariota, (wsp´olpraca mi edzynarodowa), 1996.↪
- Bakteria Escherichia coli (4 000 kbp), 1997.
- Nicie´n Caenorhabditis elegans (100 000 kbp) 1998.
- Czlowiek, chromosom 22, (35 000 kbp) 1999.
- Czlowiek, chromosom 21, (34 000 kbp) 2000.
- Muszka owocowa Drosophila melanogaster (160 000 kbp) 2000.
- Rzodkiewnik Arabidopsis thaliana (100 000 kbp), 2000.
- Czlowiek, caly genom Homo sapiens (3 500 000 kbp), 2001.
- Mysz Mus musculus (3 000 000 kbp), 2002.
- Kurczak Gallus gallus (1 300 000 kbp), 2004.
- Ry˙z Oryza sativa (390 000 kbp), 2005.
- Szympans Pan troglodytes (3 100 000 kbp), 2005.
9.5 Projekt poznania genomu czlowieka (Human Genome
Project)
Zapis calego genomu zajmie (u˙zywaj ac alfabetu A,C,G,T) okolo 750 Mb↪ pami eci.↪ Inicjatywa projektu powstala w USA pod koniec 1984. Uruchomienie projektu nast apilo w 1988.↪ Gl´own a rol↪ e przy realizacji przewidziano dla↪ NIH (National Institutes of Health), ale r´ownie˙z mocno zaanga˙zowany jest Departament Energii. Projekt zaplanowano na 15 lat i l aczny bud˙↪ zet 3 mld USD (po 200 mln USD na rok). Jest to obecnie bardzo du˙ze mi edzynarodowe przedsi↪ ewzi↪ ecie,↪ w kt´orym udzial bior a m.in.: USA, Francja, Japonia, Niemcy, Rosja, Wielka↪ Brytania. W lutym 2001 zaanonsowano uko´nczenie pierwszego szkicu calego genomu czlowieka (publikacja Human Genome Project w Nature oraz prywatnej firmy C. Ventera o nazwie Cellera w Sciene). W w/w szkicu jest du˙zo bl ed´↪ ow, pewne fragmenty nie s a calkowicie poznane, brak jest opisu sekwencji ko-↪ duj acych.↪
10 Pewne metody rekombinacji DNA
10.1 Klonowanie
10.1.1 Enzymy restrykcyjne
Tn a dwuniciowe DNA w specyficznym miejscu wyznaczonym przez charak-↪ terystyczny dla tego enzymu ci ag nukleotyd´↪ ow. Np. enzym EcoRI wyt- warzany przez E. coli tnie pomi edzy G oraz A (w nici wiod↪ acej) oraz pomi↪ edzy↪ A oraz G (w nici op´o´zniaj acej), je´↪ sli napotka nast epuj↪ ac↪ a sekwencj↪ e:↪ 5’... GAATTC... 3’ 3’... CTTAAG... 5’ (Tab. s.65,W) – przyklady enzym´ow restrykcyjnych. Zako´nczenie dwuniciowego DNA o nier´ownych ko´ncach nazywa si e↪ lep- kim ko´ncem (sticky end). Lepkie ko´nce mo˙zna enzymatycznie dol acza´↪ c do “t epych” ko´↪ nc´ow.
10.1.2 Wektory plazmidowe
Plazmid to mala kolista cz astka DNA, kt´↪ ora nie jest zwi azana z ˙↪ zadnym chromosomem. Mo˙ze by´c wprowadzona do kom´orki bakterii, od kt´orej si e↪ wywodzi. Cz esto u˙↪ zywa si e plazmid´↪ ow E. coli. Plazmid musi zawiera´c
YAC: (sztuczny chromosom dro˙zd˙za) ≤ 1000 kbp.
10.2 Metody sekwencjonowania
10.2.1 Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (1977)
Przeprowadza si e cztery reakcje chemiczne, kt´↪ ore tn a ni´↪ c DNA w miejscach G, A+G (puryny), C+T (pirymidyny), C. Reakcja jest tak przeprowadzana aby ka˙zd a ni´↪ c przeci a´↪c tylko w jednym miejscu. Nast epnie, u˙↪ zywaj ac elektro-↪ forezy na ˙zelu, por´ownuje si e dlugo´↪ sci poci etych fragment´↪ ow (radioaktywnie zaznacza si e jeden koniec nici i przeprowadza autoradiografi↪ e pr↪ a˙↪zk´ow pow- stalych w ˙zelu). Ta metoda jest pracochlonna i kosztowna. Rysunek: (5-3,W) – ilustracja metody Maxama-Gilberta.
10.2.2 Metoda enzymatyczna Sangera (1977)
Matryc a jest jednoniciowe DNA. Do niej dol↪ acza si↪ e starter (tzw.↪ primer), jest on syntetycznie wyprodukowany. Jego koniec 5’ jest oznakowany ra- dioaktywnie. Proces przeprowadza si e w 4 prob´↪ owkach. W ka˙zdej z nich zna- jduje si e matryca ze starterem, nukleotydy A, C, G, T oraz jeden z czetrech↪ rodzaj´ow nukleotyd´ow pozbawiony grupy 3’-hydroksylowej (tzw. dideoksy ATP, CTP, GTP, TTP). Do tego dodaje si e enzym DNA polimerazy, kt´↪ ory powoduje wydlu˙zanie nici zaczynaj acej sie starterem. Dolaczenie w danym↪ momencie dideoksy powoduje, ˙ze proces wydlu˙zania zostaje zatrzymany (bo nie ma ko´nca 3’). Nast epnie denaturuje si↪ e podw´↪ ojne nici, wykonuje elek- troforez e dla por´↪ ownania dlugo´sci i przeprowadza autoradiografi e pr↪ a˙↪zk´ow powstalych w ˙zelu. Rysunek: (5-4, W) – ilustracja metody Sangera.
10.3 Technika PCR
PCR, reakcja la´ncuchowa polimerazy (Polimerase Chain Reaction) odkryta przez Kary Mullis (∼ 1985) jest u˙zywana do szybkiego kopiowania materialu genetycznego. Proces ma charakter wzrostu wykladniczego. Podstawowe kroki procesu: Zal´o˙zmy, ˙ze chcemy powieli´c material genetyczny zawarty w pewnym regionie DNA. Wytwarzamy syntetycznie startery (dwa rodzaje), kt´orych pozycje b ed↪ a ograniczaly ten region z obu stron.↪ Dajemy bardzo du˙zo starter´ow oraz wolnych nukleotyd´ow do materialu, kt´ory mamy powieli´c. Dodajemy enzym polimerazy (zwykle Taq polimeraz e z bakterii↪ Thermus aquaticus, kt´ora ˙zyje w gor acych ´↪ zr´odlach – mo˙ze wydlu˙za´c nici w temperaturze do 72C). Nast epnie powtarzamy cyklicznie nast↪ epuj↪ ace trzy kroki:↪
- Podgrzewamy roztw´or do temperatury 95C. Nat epuje denaturacja nici↪ materialu genetycznego.
- Ochladzamy do 60C. W´owczas startery l acz↪ a si↪ e z pojedynczymi ni´↪ cmi. Poniewa˙z materialu genetycznego jest malo w por´ownaniu z liczb a↪ starter´ow to szansa pol aczenia nici materialu genetycznego ze sob↪ a jest↪ mala.
- Nat epuje faza budowania nowych (komplementarnych) nici przez en-↪ zym polimerazy. Po zako´nczeniu tej fazy cykl powtarzamy tak dlugo a˙z uzyskamy odpowiedni a ilo´↪ s´c materialu genetycznego.
Po ka˙zdym cyklu PCR ilo´s´c materialu genetycznego podwaja si e.↪ W ten spos´ob mo˙zna powiela´c (amplifikowa´c) fragmenty o dlugo´sci do 20 kbp. Przykladowe zastosowanie: wykrywanie obecno´sci wirusa HIV w bardzo wczes- nym stadium zara˙zenia (przed wyst apieniem objaw´↪ ow). Rysunek: (7-27,L) – ilustracja techniki PCR.
Literatura (do cz e´↪sci biologicznej):
- “J ezyk gen´↪ ow”, P. Berg, M. Singer, Pr´oszy´nski i S-ka, 1997.
- “Genom czlowieka”, red. W. Krzy˙zosiak, PWN, Warszawa, 1997.
- “Genetyka molekularna”, red. P. W egle´↪ nski, PWN, Warszawa, 1998.
- “Recombinant DNA”, J.D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski, M. Zoller, Scientific American Books, 1992.
- “Podstawy biologii kom´orki. Wprowadzenie do biologii molekularnej”, B. Alberts, D. Bray, et.al., PWN, Warszawa, 1999.
- “Molecular Biology of the Cell, Fourth Edition”, B. Alberts, A. John- son, ..., Garland Science, 2002.
