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Espectroscopia de absorção e de fluorescência
Absorção de luz UV-visível (transições eletrônicas em moléculas)
(De acordo com “Molecular Fluorescence” de Bernard Valeur, 2005)
Uma transição eletrônica consiste na passagem de um elétron de um orbital molecular no estado fundamental para um orbital não ocupado por absorção de um fóton. Portanto, diz-se que a molécula está em um estado excitado. Primeiro veremos os vários tipos de orbitais moleculares. Um orbital σ pode ser formado por dois orbitais atômicos s, ou por um s e um p, ou a partir de dois orbitais p tendo um eixo colinear de simetria. A ligação formada deste modo é chamada de ligação σ. Um orbital π é formado a partir de dois orbitais atômicos p sobrepondo-se lateralmente. A ligação resultante é chamada de ligação π. Por exemplo, em etileno (CH 2 =CH 2 ), os dois átomos de carbono estão unidos por uma ligação σ e por uma ligação π. A absorção de um fóton com energia apropriada pode promover a passagem de um dos elétrons π para um orbital não ocupado denominado π*. A transição é então chamada π →
π. A excitação de um elétron σ requer uma energia muito maior (absorção no UV distante) e não será considerada aqui. Uma molécula também pode possuir elétrons não ligados localizados em heteroátomos tais como oxigênio ou nitrogênio. Os orbitais moleculares correspondentes são chamados orbitais n. A excitação de um elétron não ligado para um orbital não ocupado é possível e a transição associada é denotada por n → π. A energia dessas transições eletrônicas está, geralmente, na seguinte ordem: n → π* < π → π* < n → σ* < σ → π* < σ → σ*
Para ilustrar esses níveis de energia, a Figura 3.1 mostra o formaldeído como exemplo, com todas as possíveis transições. A transição n → π* necessita de mais atenção: sob excitação, um elétron é removido do átomo de oxigênio e vai para o orbital π, localizado parte sobre o átomo de carbono e parte sobre o átomo de oxigênio. O estado excitado n → π tem um caráter de transferência de carga, caracterizado por um aumento no momento de dipolo de aproximadamente 2D em relação ao momento de dipolo no estado fundamental de C=O (3D). (1 C m = 2.9979 × 10^29 D (debye)). Em espectroscopia de absorção e fluorescência, dois tipos importantes de orbitais são considerados: o orbital molecular ocupado de mais alta energia (HOMO) e o orbital molecular não ocupado de mais baixa energia (LUMO). Ambos referem-se ao estado fundamental da molécula. Por exemplo, no formaldeído, o HOMO é o orbital n e o LUMO é o orbital π*. (Figura 3.1).
Figura 3.1. Níveis de energia de orbitais moleculares do formaldeído (HOMO: orbital molecular ocupado de mais alta energia; LUMO: orbital molecular desocupado de mais baixa energia) (Bernard Valeur, 2001).
Quando um de dois elétrons de spins opostos (pertencentes ao orbital molecular no estado fundamental) é transferido para um orbital molecular de maior energia, seu spin, em princípio, não é alterado; então o número quântico de spin total (S = Σsi, com si = + ½ ou – ½ ) permanece igual a zero. Por causa da multiplicidade dos dois estados, fundamental e excitado, (M = 2S + 1) ser igual a
carbono-carbono alternadas simples e duplas (nos chamados sistemas conjugados). Na verdade, a sobreposição dos orbitais π permite que os elétrons estejam “delocalizados” sobre todo o sistema (efeito de ressonância). 1,3- Butadieno e benzeno são os casos mais simples de sistemas conjugados, linear e cíclico, respectivamente (Figura 3.3).
Figura 3.3. Exemplos de moléculas com sistemas conjugados, à esquerda: 1,3- butadieno (linear); à direita: benzeno (cíclico) (Bernard Valeur, 2001).
Porque não há sobreposição entre os orbitais σ e π, o sistema de elétrons π pode ser considerado como independente das ligações σ. Quanto maior a extensão do sistema de elétrons π, menor a energia da transição π → π* e, conseqüentemente, maior o comprimento de onda da banda de absorção correspondente. Esta regra aplica-se a sistemas conjugados lineares (polienos) e sistemas conjugados cíclicos (moléculas aromáticas).
Lei de Beer - Lambert
A probabilidade de absorção para um único comprimento de onda é caracterizada pelo coeficiente de absorção molar para aquele comprimento de onda. Isto é mais facilmente definido em termos de como ele é medido. Se luz de intensidade I 0 passa através de uma substância (que pode estar em solução) de espessura d e concentração molar c , a intensidade I da luz transmitida obedece a lei de Beer-Lambert:
I = I 0 10 −^ ε d^ c
ou log ( I 0 / I ) = ε d c
em que ε é o coeficiente de absorção molar. Os dados de absorção podem ser colocados em porcentagem (%) de transmissão ( T = 100 I / I 0 ) ou, mais comu- mente, como a absorvância A = log ( I 0 / I ). Quando d = 1 cm, A é comumente chamado de densidade ótica (ODλ), em que o índice λ informa o comprimento de onda em que a medida foi feita. A densidade ótica é conveniente, pois é igual a
( ε. c ). Em alguns casos, se a concentração é alta, ε aparece como uma função de c
e pode ser dito que a lei de Beer-Lambert, nesse caso, não é válida. Isto pode
resultar da alta absorção, do espalhamento ou das mudanças estruturais (por exemplo: dimerização, agregação, ou mudanças químicas) para concentrações altas. A espectroscopia de absorção é uma técnica que consiste em obter dados de absorção ótica de uma amostra diluída por meio de um feixe de luz incidente cujo comprimento de onda varia do infravermelho até o ultravioleta. O espectrofotômetro é composto de um sistema ótico e da eletrônica acoplada a um computador por meio de uma placa de interface para controle e aquisição de dados. Apesar de variarem em desenho, todos os espectrofotômetros consistem de uma fonte de luz, um monocromador (para a seleção dos comprimentos de onda), um porta-amostra transparente chamado de cubeta, um detector de luz, e um registrador para acumular os dados de saída do detector. A Figura 3.4 mostra o esquema do espectrofotômetro HP-8452A , com detecção por arranjo de diodos.
Figura 3.4. Esquema do espectrofotômetro HP-8452A. A luz da lâmpada passa através da amostra e solvente contidos em uma cubeta. Em seguida passa pela rede de difração, para seleção do comprimento de onda, e atinge o arranjo de diodos para a detecção (da Silva, Tese de mestrado, PUC-Rio).
solvente durante colisões da molécula excitada com as moléculas do solvente na sua vizinhança. Tempo característico de 10-11^ a 10-9^ s.
- Fluorescência – a emissão de fótons que acompanha a relaxação S 1 → S 0 é chamada de fluorescência. Deve ser enfatizado que, apesar de algumas exceções, a emissão de fluorescência ocorre a partir de S 1 e suas características (exceto polarização) não dependem do comprimento de onda de excitação (considerando que somente exista uma espécie no estado fundamental). A transição 0-0 é geralmente a mesma para absorção e fluorescência. No entanto, o espectro de fluorescência é localizado em comprimentos de onda maiores (energia mais baixa) que o espectro de absorção, por causa da perda de energia no estado excitado devido à relaxação vibracional. De acordo com a regra de Stokes (uma observação empírica anterior ao diagrama de Jablonski), o comprimento de onda de emissão de fluorescência deve ser sempre maior que o da absorção. Entretanto, na maioria dos casos, o espectro de absorção intercepta parcialmente o espectro de fluorescência, isto é, uma fração de luz é emitida em comprimento de onda menor que a luz absorvida. Tal observação parece estar, em um primeiro momento, em contradição com o princípio da conservação da energia. No entanto, isto pode ser explicado (como observou Einstein pela primeira vez) pelo fato de que em temperatura ambiente uma pequena fração de moléculas está em um nível vibracional maior que o nível 0 (distribuição entre os níveis de energia de acordo com a lei de Boltzmann), tanto no estado fundamental como no estado excitado. Em temperaturas baixas, essa violação da lei de Stokes deve desaparecer. Em geral, as diferenças entre os níveis vibracionais são similares nos dois estados: fundamental e excitado, tanto que o espectro de fluorescência frequentemente apresenta a primeira banda de absorção (regra do espelho). O intervalo (expresso em número de onda) entre o máximo da primeira banda de absorção e o máximo de fluorescência é chamado de desvio de Stokes. Deve ser percebido que a emissão de um fóton é tão rápida quanto à absorção de um fóton (≅ 10 -15^ s). Entretanto moléculas excitadas ficam no estado S 1 por certo tempo (de poucas dezenas de picosegundos a poucas centenas de nanosegundos, dependendo do tipo da molécula e do meio) antes de emitir um fóton ou percorrer outros processos de desexcitação. Então, após a excitação de uma população de moléculas por um pulso de luz muito curto, a intensidade da
fluorescência decresce exponencialmente com um tempo característico, refletindo o tempo de vida médio das moléculas no estado excitado S 1.
- Cruzamento intersistema – é uma transição não-radiativa entre dois níveis vibracionais isoenergéticos pertencentes a estados eletrônicos de multiplicidades diferentes. Por exemplo, uma molécula excitada no nível vibracional 0 do estado S 1 pode mover-se para o nível vibracional isoenergético do estado tripleto Tn; então a conversão interna seguida da relaxação vibracional leva-a para o nível vibracional mais baixo de T 1. Cruzamento intersistema pode ser rápido suficientemente (10-7^ – 10 -9^ s) para competir com outros caminhos de desexcitação a partir de S 1 (fluorescência e conversão interna S 1 → S 0 ). - Fosforescência versus desexcitação não-radiativa – em solução a temperatura ambiente, desexcitação não-radiativa a partir do estado tripleto T 1 é predominante sobre desexcitação radiativa chamada fosforescência. Na verdade, a transição T 1 → S 0 é proibida (mas pode ser observada devido ao acoplamento spin-órbita), e a constante de decaimento radiativo é muito pequena. Durante esse processo, que é lento, ocorrem numerosas colisões com moléculas do solvente que favorecem o cruzamento intersistema e a relaxação vibracional em S 0. Em temperaturas baixas e/ou em meios rígidos, a fosforescência pode ser observada. O tempo de vida do estado tripleto pode, nessas condições, ser longo o suficiente para se observar a fosforescência em uma escala de tempo até segundos, até minutos ou mais. O espectro de fosforescência é localizado em comprimentos de onda maiores que no espectro de fluorescência, porque a energia do nível vibracional mais baixo do estado tripleto T 1 é menor que o do estado singleto S 1. - Fluorescência com retardo ativada termicamente – cruzamento intersistema reverso T 1 → S 1 pode ocorrer quando a diferença de energia entre S 1 e T 1 é pequena e quando o tempo de vida de T 1 é suficientemente grande. Isso resulta em uma emissão com a mesma distribuição espectral da fluorescência normal, mas com uma constante de decaimento de tempo muito maior, porque a molécula fica no estado tripleto antes de emitir de S 1. Esta emissão de fluorescência é ativada termicamente, consequentemente sua eficiência aumenta com o aumento da temperatura.
ótico contém várias partes: um porta-amostra, fendas, polarizadores e um espalhador de feixe para fotodiodos.
Figura 3.6. Diagrama esquemático de um espectrofluorímetro com geometria perpendicular para excitação e emissão (modificado de Lakowicz, 2006).
O espectro de emissão mostra as intensidades de fluorescência em função do comprimento de onda de emissão, e obtém-se fixando o comprimento de onda da luz de excitação. Ele representa a transição do nível vibracional mais baixo do primeiro estado excitado S 1 para o estado fundamental S 0. O espectro de fluorescência pode nos informar sobre reações no estado excitado do fluoróforo, enquanto que o espectro de absorção pode nos fornecer informações sobre reações do estado fundamental. O espectro de excitação mostra as intensidades de fluorescência em função do comprimento de onda da luz de excitação, obtém-se mantendo o detector em um mesmo comprimento de onda, em geral no máximo de emissão. No caso de uma solução homogênea de um fluoróforo, o espectro de excitação corrigido corresponderá ao espectro de absorção, desde que o relaxamento radiativo ocorra do nível vibracional fundamental do estado
eletrônico excitado. Este parâmetro irá mudar se a energia potencial relativa entre os estados excitado e fundamental for modificada por alguma perturbação. O rendimento quântico é definido como a razão entre o número de fótons emitidos pelo número total de fótons absorvidos. O rendimento quântico é geralmente determinado pela comparação com uma fluorescência padrão, isto é, um composto de rendimento quântico conhecido que atende aos seguintes critérios (Demas, 1982 em Valeur, 2005): Prontamente disponível em uma forma altamente pura; Estável fotoquimicamente em solução e em estado sólido na armazenagem; Alto rendimento quântico de fluorescência precisamente conhecido; Espectros de absorção e fluorescência amplos, sem características acentuadas, para evitar erros; Espectro de fluorescência e rendimento quântico independentes do comprimento de onda de excitação; Pequena sobreposição entre os espectros de absorção e emissão para evitar erros de auto-absorção (grande deslocamento de Stokes); Emissão não polarizada.
A fluorescência apresenta grandes vantagens quando comparada a outros métodos de espectroscopia, pois é muito sensível a vizinhança do fluoróforo, tem um amplo espectro de análise e o erro inerente à medição é praticamente constante em todo o intervalo de resposta. A sensibilidade da fluorescência é uma consequência do longo tempo que o fluoróforo permanece no estado excitado antes do decaimento. O estado singleto leva aproximadamente 10−^9 s para decair. Durante esse tempo vários processos podem ocorrer, tais como reações de protonação / desprotonação, mudanças conformacionais locais em proteínas e interações de diversas drogas com biomoléculas. A fluorescência pode ser suprimida (supressão da fluorescência), resultado da interação entre o composto fluorescente e outras substâncias presentes na solução, por efeitos da temperatura, por efeitos de filtro interno, pela presença de oxigênio ou impurezas na solução. Além disso, em concentrações elevadas pode ocorrer a formação de dímeros ou polímeros maiores, o que origina a diminuição da eficiência quântica e a alteração dos espectros de absorção e emissão,
primeira técnica trabalha no domínio de tempo, e a segunda no domínio de frequência. Fluorimetria por pulso e fluorimetria por modulação e fase são teoricamente equivalentes, mas os princípios dos instrumentos são diferentes (Figura 3.7). Somente iremos tratar de fluorimetria por pulso, pois a utilizamos neste trabalho.
Figura 3.7. Princípios de fluorimetria resolvida no tempo (modificado de Valeur, 2005).
Fluorimetria por pulso
A amostra é excitada por um pulso de luz curto e a resposta da fluorescência é apresentada como uma função do tempo. Se a duração do pulso é longa em relação às constantes de tempo do decaimento da fluorescência, a resposta da fluorescência será dada por um produto de convolução, dado por:
t R ( t ) E ( t ) I ( t ) E ( t ') I ( t t ') dt '
A intensidade da fluorescência aumenta, passa por um máximo e torna-se idêntica a verdadeira resposta de pulso δ, i(t) , tão rápido que a intensidade do pulso de luz é desprezada. Neste caso, a análise dos dados para a determinação dos parâmetros característicos da resposta de pulso δ requer a deconvolução da resposta de fluorescência. Suponhamos que uma amostra contendo um fluoróforo é excitada com um pulso de luz infinitamente curto resultando em uma população inicial N 0 de fluoróforos no primeiro estado excitado singleto. A população no estado excitado decai a uma taxa kr + knr de acordo a equação dN dt ( t )= −( kr + knr )⋅ N ( t ) 3.
sendo N ( t ) o número de moléculas excitadas no tempo t , kr a taxa radiativa (fluorescência ou fosforescência), e knr a taxa de decaimento não radiativa. A emissão é um evento aleatório, e cada fluoróforo tem a mesma probabilidade de emitir em um dado período de tempo. Integrando a equação 3.1, obtemos um decaimento exponencial da população excitada, da seguinte forma
N = N 0 ⋅exp(− t / τ) 3.
Como a intensidade radiativa ( I ) é proporcional a N ( t ) podemos expressa-la como I = α ⋅exp(− t / τ ) 3.
sendo τ = ( kr + knr )−^1 o tempo de vida e α a intensidade no tempo zero.
O tempo de vida de fluorescência é geralmente igualado ao tempo requerido para a intensidade decair 63.21% (1/e) de seu valor inicial. Comumente, o tempo de vida é determinado a partir do coeficiente angular do gráfico log I ( t ) versus t (Figura 3.8). Para um decaimento multi-exponencial com n componentes, a resposta de pulso δ é:
= (^) ∑= ⋅ − n i i^ i
I t t 1
() α exp( / τ ) 3.
Observe que a intensidade fracionária da componente i, isto é, a contribuição fracionária da componente i para a intensidade estacionária, é
=
= n n i i i i i
n i i i a 1 1
Onde ai representa as amplitudes fracionárias
=
n i i
ai i 1
α
α (^) 3.
Com 1 1
∑^ =
=
n i i
a. Esta média é chamada tempo de decaimento com média nas
amplitudes (ou tempo de vida). A definição usada depende do fenômeno em estudo. Por exemplo, o tempo de vida com média nas intensidades deve ser usado para o cálculo de uma constante de supressão média colisional; enquanto que em experimentos de transferência de energia ressonante, o tempo de decaimento com média nas amplitudes ou tempo de vida deve ser usado para o cálculo da eficiência da transferência de energia.
Fluorímetro de contagem de fóton único
A fluorimetria de pulso é a técnica mais popular para a determinação de tempos de vida (ou parâmetros de decaimento). Muitos instrumentos são baseados no método de contagem de fóton único correlacionado no tempo (TCSPC – time- correlated single-photon counting), ou simplesmente contagem de fótons. Neste trabalho foi utilizado um instrumento desse tipo. O princípio básico se fundamenta no fato de que a probabilidade de detecção do primeiro fóton no tempo t depois de um pulso de excitação é proporcional à intensidade de fluorescência naquele tempo. Após a contagem e gravação dos primeiros fótons detectados depois de um grande número de pulsos de excitação, a curva de decaimento da intensidade de fluorescência é reconstruída. A Figura 3.9 mostra um instrumento convencional de contagem de fóton único. A fonte de excitação pode ser uma lâmpada de flash ou um laser. Um pulso elétrico associado com o pulso ótico é gerado e dirigido – através de um discriminador – para a entrada do sinal de início do conversor de tempo em amplitude (TAC – time-to-amplitude converter). Nesse tempo, a amostra é
excitada pelo pulso ótico e emite fluorescência. O sistema ótico é ajustado de modo que o fotomultiplicador não detecte mais que um fóton por cada pulso de excitação. O correspondente pulso elétrico é dirigido – através de um discriminador – para a entrada do sinal de parada do TAC. Este último gera um pulso de saída cuja amplitude é diretamente proporcional ao intervalo de tempo entre os pulsos de início e parada. O intervalo de tempo é convertido em um valor digital por meio de um conversor analógico-digital.
Figura 3.9. Diagrama esquemático de um fluorímetro de contagem de fóton único (modificado de Valeur, 2005).
O analisador multicanal aumenta de uma unidade o conteúdo da memória do canal correspondente ao valor digital do pulso detetado. Depois de um grande número de eventos de excitação e deteção, é montado um histograma das alturas dos pulsos detetados que representa a curva de decaimento da fluorescência. Obviamente, quanto maior o número de eventos, mais precisa será a curva de
