Espectroscopia de Fluorescência Atómica, Notas de estudo de Bioquímica e Instrumentação

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MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/

Espectroscopia de

Fluorescência Atómica

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES

 - Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/ 

• Introdução Índice
• Descrição.........................................................................................
  • Fluoróforos
  • Espetro de Emissão e Absorção
  • Espetrofluorómetro
• Enquadramento
• Conclusão
• Bibliografia......................................................................................

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES

Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/

Descrição

Fluoróforos

Quando se fala de fluorescência, é inevitável não mencionar e abordar as moléculas responsáveis por este fenómeno, os fluoróforos. Estes consistem em moléculas tipicamente aromáticas (quinina, fluoresceína e rodamina) ou com a presença de muitas ligações duplas. Podem classificar-se em 2 grupos, os intrínsecos e extrínsecos. Os intrínsecos caracterizam-se pela emissão de luz de forma natural, já os extrínsecos são adicionados à amostra para lhe conferir capacidade de emissão de luz. Os fluoróforos emitem luz na faixa dos comprimentos de onda do espectro visível, entre o infravermelho e o ultravioleta e são definidos como moléculas com baixa energia eletrónica, sendo por isso excitados com ondas de radiação na ordem dos 250 nm. Alguns compostos como nucleótidos, lípidos, hidratos de carbono e aminoácidos não aromáticos apresentam baixa fluorescência. Os que apresentam fluorescência com maior intensidade são os grupos funcionais aromáticos, compostos que contenham grupos carbonilo alifáticos^1 e alicíclicos^2 ou compostos com ligações duplas, as drogas e vitaminas. No entanto, estima-se que existe uma maior ocorrência de fluorescência em moléculas com estruturas mais resistentes, pois quando a molécula não apresenta uma estrutura consistente, uma parte dessa sofre vibrações de baixa frequência, tendo movimentos mais fracos devido à perda de energia.

Espetro de Emissão e Absorção

Os espetros de emissão e absorção são conceitos indispensáveis para o procedimento, pois são bastante úteis para caracterizar os compostos fluorescentes. Os espectros são registados através de um espetrofluorómetro, onde será possível observar uma variação de comprimentos de onda de radiação, até que o fenómeno de fluorescência ocorra, conseguindo este ser observado visualmente. (^1) São hidrocarbonetos que podem ser de cadeira aberta (alcanos, alcenos, alcinos) ou fechada (compostos cíclicos). Compostos orgânicos mais simples constituídos somente por átomos de carbono e hidrogénio e não contêm grupos benzeno, cuja sua nomenclatura baseia-se no nº de carbonos constituintes. (^2) Compostos acetónicos de cadeia fechada.

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/ Após a estabilização do espetrofluorómetro, retira-se então o valor do comprimento de onda de excitação e, o espetro de emissão é registado medindo a radiação de fluorescência durante a varredura do comprimento de onda, ou seja, até à paragem de variação de comprimentos de onda. O comprimento de onda de emissão é definido para o valor máximo de fluorescência e encontra-se dependente do total de energia absorvida pelo fluoróforo. Relativamente ao espetro de absorção e de excitação, pode concluir-se que, geralmente, são bastante similares. Espectros de fluorescência são apresentados como espectros de emissão, que consiste na intensidade de fluorescência emitida em função do comprimento de onda, em nanômetros. Este é localizado em comprimentos de onda maiores (energia mais baixa) que o espectro de absorção devido à perda energética que ocorre no estado excitado da molécula, devido ao relaxamento vibracional. Outra característica da fluorescência é que o mesmo espectro de emissão pode ser visualizado para diferentes comprimentos de onda de excitação. Para além dos conceitos abordados precedentemente, é de importância referir que o tempo de vida de fluorescência e o rendimento quântico são também fundamentais para o conhecimento da fluorescência e do fluoróforo. O rendimento quântico caracteriza-se como a razão do número de fotões emitidos pelo número de fotões absorvidos. Sabe-se que compostos com um grande rendimento quântico, por exemplo a fluoresceína, apresentam uma emissão bastante brilhante. 𝑛º 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑚 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑞𝑢â𝑛𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑛º 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑚 𝑒𝑥𝑐𝑖𝑡𝑎çã𝑜 Este valor pode-se obter numa escala de 0 a 1, sendo que 0 corresponde quando a espécie não emite fluorescência e 1 quando está com uma emissão elevada. O tempo de vida reflete o tempo disponível para o fluoróforo interagir com o meio e disponibilizar a informação da sua emissão.

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/ Relativamente às varreduras automáticas dos comprimentos de onda, estas são realizadas por monocromadores monitorizados, controlados através de dispositivos eletrónicos, por exemplo, o computador.

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Enquadramento

Devido à intensidade da radiação fluorescente é permitido determinar quantitativamente a presença de espécies orgânicas e inorgânicas, no entanto, este método tem limites de deteção muito baixos na ordem dos ppb (μg/L). Uma molécula ou partícula nesta técnica volta ao seu estado fundamental após a excitação à radiação, o que é bastante favorável e porque diminui o tempo do seu estado excitado após a exposição à radiação, considerando-se um processo de fluorescência rápido. Durante o processo de excitação eletrónica, uma molécula passa por vários níveis de vibrações, mas na presença de uma solução, as colisões das moléculas com o solvente produzem um excesso de energia vibracional que se dissipa e origina uma transferência de energia, com um pequeno aumento da temperatura. Afirma-se, que o tempo médio de vida da molécula excitada no momento da fase vibracional é de 10-^13 a 10-^10 segundos, sendo esse muito menor que o tempo de vida num estado de excitação eletrónica, pois a fluorescência ao ser feita numa substância em solução, inicia o seu estado vibracional na mais baixa energia de estado excitado. Uma desvantagem do aumento do estado vibracional é relativa à banda de fluorescência, consistindo numa transição eletrónica passar para a zona dos maiores comprimentos de onda em relação à banda de absorção, sobrepondo-se assim os picos de ressonância de um estado fundamental para o nível vibracional mais baixo em relação ao estado excitado. O efeito do aumento da fluorescência devesse ao facto de ser colocada a substância em condições que ocorra uma diminuição do número de colisões entre partículas, através da diminuição da temperatura ou um aumento da sua viscosidade. Existe diversos tipos de aparelho como os fluorómetros analógicos aos fotómetros, que usam filtros para fazer a seleção do comprimento de onda dos feixes de excitação e emissão e quando o aparelho possuí monocromadores designam-se de espectrofluorímetros sendo que esse pode ser de dois tipos. O primeiro tipo de espectrofluorímetro é constituído por um filtro para selecionar a radiação que provoca a excitação e um monocromador de rede ou prisma para isolar o pico do espectro de emissão de fluorescência. Já o segundo tipo e o mais considerado, é o espectrofluorímetro que tem na sua constituição dois monocromadores para selecionar os comprimentos de onda da radiação incidente e da emissão da fluorescência, sendo que este são aparelhos mais caros e mais específicos, desse modo, são fundamentais para determinar características estruturais das moléculas bem como trabalhos analíticos mais pormenorizados. A calibração do aparelho deve ser feita antes de se realizar cada análise da amostra, utilizando-se uma solução-padrão que tenha um valor de fluorescência um pouco maior que a amostra, como por exemplo a solução de sulfato de quinino. No

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/ Figura 3 - Espectrómetro de fluorescência atómica LUMINA 3500 Figura 4 - Espectrómetro de fluorescência atómica LC- LUMINA 3600 Figura 5 - Exemplo de uma leitura feita pelo aparelho, através da reta de calibração com base na leitura das amostras

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Conclusão

A espetroscopia de fluorescência atómica é um método analítico que se baseia nas propriedades de fluorescência de amostras especificas. Este equipamento é utilizado maioritariamente para a medida das quantidades de drogas, metabolitos e de outros produtos químicos presentes nas amostras analisadas. A utilização deste método apresenta grandes vantagens em comparação à de outros métodos de espetroscopia, porque devido à elevada sensibilidade da fluorescência existe um amplo espectro de análise e, por consequência, o erro é praticamente constante em todo o seu intervalo. No entanto também acarreta algumas desvantagens. Em primeiro lugar é um instrumento relativamente caro e difícil de manter, e em segundo a sua fluorescência pode ser suscetível a diferentes circunstâncias como o pH, a temperatura, ou ao tipo de solventes utilizados. Existem também alguns materiais que podem interferir com a fluorescência, alterando-a ou até mesmo danificando-a. Os principais materiais são os detergentes, papel de filtro e o próprio material do tecido em causa. No caso de ocorrerem alguns destes percalços, a fluorescência pode ser perdida devido interação com outras moléculas e principalmente em amostras concentradas. Contudo, embora esta técnica ainda não seja muito utilizada e valorizada no nosso quotidiano, devido ao grande sucesso de métodos de emissão e de absorção atómica (tratam-se de métodos menos específicos e mais abrangentes em relação ao da EFA), muitos estudos demostram que no futuro algumas das suas desvantagens poderão ser atenuadas tornando-se a escolha mais acertada face às técnicas alternativas.