Espectroscopia de Fluorescência Atómica, Notas de estudo de Bioquímica e Instrumentação

Baixe Espectroscopia de Fluorescência Atómica e outras Notas de estudo em PDF para Bioquímica e Instrumentação, somente na Docsity! ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 Espectroscopia de Fluorescência Atómica ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 Índice Introdução ....................................................................................... 1 Descrição ......................................................................................... 2 Fluoróforos .................................................................................... 2 Espetro de Emissão e Absorção .................................................................... 2 Espetrofluorómetro ......................................................................... 4 Enquadramento ................................................................................ 6 Conclusão ........................................................................................ 9 Bibliografia...................................................................................... 10 ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 3 | P á g i n a Após a estabilização do espetrofluorómetro, retira-se então o valor do comprimento de onda de excitação e, o espetro de emissão é registado medindo a radiação de fluorescência durante a varredura do comprimento de onda, ou seja, até à paragem de variação de comprimentos de onda. O comprimento de onda de emissão é definido para o valor máximo de fluorescência e encontra-se dependente do total de energia absorvida pelo fluoróforo. Relativamente ao espetro de absorção e de excitação, pode concluir-se que, geralmente, são bastante similares. Espectros de fluorescência são apresentados como espectros de emissão, que consiste na intensidade de fluorescência emitida em função do comprimento de onda, em nanômetros. Este é localizado em comprimentos de onda maiores (energia mais baixa) que o espectro de absorção devido à perda energética que ocorre no estado excitado da molécula, devido ao relaxamento vibracional. Outra característica da fluorescência é que o mesmo espectro de emissão pode ser visualizado para diferentes comprimentos de onda de excitação. Para além dos conceitos abordados precedentemente, é de importância referir que o tempo de vida de fluorescência e o rendimento quântico são também fundamentais para o conhecimento da fluorescência e do fluoróforo. O rendimento quântico caracteriza-se como a razão do número de fotões emitidos pelo número de fotões absorvidos. Sabe-se que compostos com um grande rendimento quântico, por exemplo a fluoresceína, apresentam uma emissão bastante brilhante. 𝑛º 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑚 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑞𝑢â𝑛𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑛º 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙é𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑚 𝑒𝑥𝑐𝑖𝑡𝑎çã𝑜 Este valor pode-se obter numa escala de 0 a 1, sendo que 0 corresponde quando a espécie não emite fluorescência e 1 quando está com uma emissão elevada. O tempo de vida reflete o tempo disponível para o fluoróforo interagir com o meio e disponibilizar a informação da sua emissão. ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 4 | P á g i n a Espetrofluorómetro Figura 1 - Esquema do mecanismo do Espetrofluorómetro, https://www.maxwell.vrac.puc- rio.br/17692/17692_4.PD1F A respeito do equipamento, espetrofluorómetro, abordar-se-á a sua constituição. Este é constituído por uma fonte de luz, que habitualmente constitui uma lâmpada de xenônio de elevada pressão, que confere a vantagem de emissão contínua de comprimentos de onda na gama dos 250 nm, até ao infravermelho. Possui na sua constituição um monocromador de excitação, que é responsável pela seleção do comprimento de onda de excitação. Esta radiação “especifica”, vai ser incidida na amostra em ângulo reto em relação ao feixe incidente, de forma a minimizar as contribuições do espalhamento e radiação intensa da fonte. A fluorescência é detetada por um monocromador de emissão, que possui como função isolar a emissão de fluorescência, por um fotomultiplicador. O módulo ótico é constituído por um porta amostra (onde se posiciona a mesma), fendas (permite a passagem do espectro de excitação de forma a atingir a amostra), polarizadas e um espalhador de feixe para fotodiodos. ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 5 | P á g i n a Relativamente às varreduras automáticas dos comprimentos de onda, estas são realizadas por monocromadores monitorizados, controlados através de dispositivos eletrónicos, por exemplo, o computador. ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 8 | P á g i n a Figura 3 - Espectrómetro de fluorescência atómica LUMINA 3500 Figura 4 - Espectrómetro de fluorescência atómica LC- LUMINA 3600 Figura 5 - Exemplo de uma leitura feita pelo aparelho, através da reta de calibração com base na leitura das amostras ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 9 | P á g i n a Conclusão A espetroscopia de fluorescência atómica é um método analítico que se baseia nas propriedades de fluorescência de amostras especificas. Este equipamento é utilizado maioritariamente para a medida das quantidades de drogas, metabolitos e de outros produtos químicos presentes nas amostras analisadas. A utilização deste método apresenta grandes vantagens em comparação à de outros métodos de espetroscopia, porque devido à elevada sensibilidade da fluorescência existe um amplo espectro de análise e, por consequência, o erro é praticamente constante em todo o seu intervalo. No entanto também acarreta algumas desvantagens. Em primeiro lugar é um instrumento relativamente caro e difícil de manter, e em segundo a sua fluorescência pode ser suscetível a diferentes circunstâncias como o pH, a temperatura, ou ao tipo de solventes utilizados. Existem também alguns materiais que podem interferir com a fluorescência, alterando-a ou até mesmo danificando-a. Os principais materiais são os detergentes, papel de filtro e o próprio material do tecido em causa. No caso de ocorrerem alguns destes percalços, a fluorescência pode ser perdida devido interação com outras moléculas e principalmente em amostras concentradas. Contudo, embora esta técnica ainda não seja muito utilizada e valorizada no nosso quotidiano, devido ao grande sucesso de métodos de emissão e de absorção atómica (tratam-se de métodos menos específicos e mais abrangentes em relação ao da EFA), muitos estudos demostram que no futuro algumas das suas desvantagens poderão ser atenuadas tornando-se a escolha mais acertada face às técnicas alternativas. ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE DR. LOPES DIAS MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE ANÁLISES Ciências Biomédicas Laboratoriais – 2020/2021 10 | P á g i n a Bibliografia  Gonçalves, M.L.S.S (2001) Métodos Instrumentais para a Análise de Soluções/Análise Quantitativa, 4ªedição, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa.  Halpern, M.J (1997) Bioquímica, edição revista, Lidel, Lisboa-Porto-Coimbra.  https://www.news-medical.net/life-sciences/Spectroscopy-Applications- (Portuguese).aspx  https://www.news-medical.net/life-sciences/Fluorescence-Spectroscopy.aspx  https://www.aurorabiomed.com/lumina-3500/  Espectroscopia de absorção e de fluorescência, PUC-Rio – Certificação Digital nº 0521275/CA, páginas 30-47  Vandecasteele, C., Block, C.B. (1993) Modern Methods for Trace Element Determination, John wiley e Sons, Chichester – New York – Brisbane – Toronto – Singapore.