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AULA PRÁTICA
PREPARO E ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS
Preparo do material a ser esterilizado
Preparo das placas de petri Selecionar 4 placas de Petri Embalar as placas selecionadas com papel kraft conforme demonstração. Fechar utilizando barbante. Colocar fita indicadora de esterilização na embalagem pronta. Esterilizar em autoclave, por 15 minutos, a 121^0 C. Após a esterilização colocar para secar em estufa. Preparo das pipetas graduadas Selecionar 4 pipetas graduadas de 10 mL, colocar algodão hidrófobo na extremidade e embalar, individualmente, com papel kraft conforme demonstração. Colocar um pedaço de fita indicadora de esterilização. Esterilizar em autoclave, por 15 minutos, a 121^0 C. Após a esterilização colocar para secar em estufa. Preparo do Erlenmeyer Selecionar 1 erlenmeyer de 250 mL e tampá-lo. Enrolar a boca do erlenmeyer com papel kraft e passar o barbante. Colocar um pedaço de fita indicadora de esterilização. Esterilizar em autoclave, por 15 minutos, a 121^0 C. Após a esterilização colocar para secar em estufa. Preparo do meio de cultura PCA Seguir as orientações do fabricante do meio. Pesar __________ g de meio PCA (Plate Count Agar), adicionar __________ mL de água destilada, aquecer com agitação constante até a fervura. Transferir 20 mL do meio preparado para tubos (ainda quente, antes que solidifique); tampá-los Esterilizar em autoclave, por 15 minutos a 121^0 C. Após a esterilização esperar atingir a temperatura ambiente e armazenar em geladeira a 4^0 C. Preparo de tubos com solução salina peptonada Transferir 9,0 mL de solução salina peptonada para cada tubo com auxílio de uma pipeta graduada de 10 mL. Tampar os tubos.
Esterilizar em autoclave, por 15 minutos, a 121^0 C. Após a esterilização esperar atingir a temperatura ambiente e armazenar em geladeira a 4^0 C.
Composição do meio PCA
Peptona de Caseína 5,0 g Extrato de levedura 2,0 g Glicose 1,0 g Ägar 14,0 g
Preparo: Dissolver 22,5 g do meio PCA em 1 L de água destilada. O pH após esterilização é de 7,0 ± 0,2 a 25^0 C.
Composição da Solução Salina Peptonada
Cloreto de sódio 9,0 g Peptona 1,0 g Água destilada qsp 1000 mL
Preparo: dissolver 1,0 g de peptona e 9,0 g de cloreto de sódio em 1 L de água destilada com agitação contínua.
Adicionar 15 mL de meio agar caseína soja em duas placas e homogeneizar em forma de oito ou “s” sobre a bancada. Adicionar 15 mL de meio agar Sabouraud-dextrose em duas placas e homogeneizar em forma de oito ou “s” sobre a bancada. Adicionar 15 mL de meio agar de caseína soja na placa identificada como controle do meio e homogeneizar em na forma de oito ou “s” sobre a bancada. Adicionar 15 mL de meio agar Sabouraud-dextrose na placa identificada como controle do meio e homogeneizar em na forma de oito ou “s” sobre a bancada. Esperar o meio solidificar, inverter as placas e incubar a 30-35^0 C por 3-5 dias, as placas que contém agar caseína soja. Esperar o meio solidificar, inverter as placas e incubar a 20-25^0 C por 5-7 dias, as placas que contém agar Sabouraud-dextrose.
Resultados
Diluições Contagem (UFC) – agar caseína-soja
Placa 1 Placa 2
10 -^1
10 -^2
10 -^3
Diluições Contagem (UFC) – agar Sabouraud-dextrose.
Placa 1 Placa 2
10 -^1
10 -^2
10 -^3
Discussão dos resultados
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Conclusão
Referências
Retirar a membrana do sistema com auxílio de uma pinça estéril e colocar sobre o meio solidificado. Incubar a placa contendo agar caseína soja a 30-35^0 C por 4 dias. Incubar a placa contendo agar Sabouraud-dextrose a 20-25^0 C por 7 dias.
Resultados
Contagem (UFC)
Placa 1 – agar caseína-soja Placa 2 - agar Sabouraud-
dextrose
Discussão dos resultados
Conclusão
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Referências
Resultados
Diluições Tubos 1 2 3 10 -^1 10 -^2 10 -^3 Controle
Discussão dos resultados
Conclusão
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Referências
Transferir para a placa contendo agar sal manitol, usando o método de estria. Incubar a 30-35º C por 18-72 horas.
Salmonella
Homogeneizar o caldo caseína-soja e pipetar 0,1mL para um tubo contendo 10 mL de caldo para enriquecimento Salmonella Rappaport Vassiliadis. Incubar a 30-35º C por 18-24 horas. Flambar a alça platina e com ela retirar uma amostra do caldo para enriquecimento Salmonella Rappaport Vassiliadis. Transferir para a placa contendo de agar xilose lisina desoxicolato, usando o método de estrias. Incubar a 30-35º C por 18-24 horas.
Eschrerichia coli
Homogeneizar o caldo caseína-soja e pipetar 1mL para um tubo contendo 100 mL de caldo MacConkey_._ Incubar a 42-44º C por 24-48 horas. Adicionar 15 mL de Agar MacConkey na placa de Petri e esperar solidificar. Flambar a alça platina e com ela retirar uma amostra do caldo MacConkey. Transferir para a placa contendo de agar MacConkey, usando o método de estrias. Incubar 30-35o^ C durante 18-72 horas.
PROVAS MICROBIANAS Os testes a serem feitos são os sugeridos pela Farmacopeia Brasileira 4ª edição. Pseudomonas aeruginosa Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar cetrimida. Transferir para um tubo contendo agar inclinado de infusão cérebro e coração, usando o método de estrias em superfície. Flambar a alça platina. Incubar a 41o^ C, em banho-maria ou estufa por 48 horas.
Staphylococcus aureus
Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar sal manitol. Transferir para um tubo contendo 0,5 mL de plasma de coelho reconstituído. Flambar a alça platina. Incubar os tubos a 30-37o^ C, em banho-maria, por até 24 horas. Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar sal manitol,
Transferir para a placa contendo agar DNase. Incubar a placa a 30-35o^ C por 24 horas. Salmonella Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar xilose lisina desoxicolato. Transferir para um tubo contendo agar tríplice açúcar ferro inclinado. Para isto, furar a base não inclinada com fio reto, retirar e estriar na superfície inclinada. Flambar a alça de platina. Incubar 30-35o^ C durante 24-48 horas. Flambar a alça de platina. Com a alça de platina retirar uma colônia do agar xilose lisina desoxicolato. Transferir para um tubo contendo agar inclinado citrato de Simmons, usando o método de estrias em superfície. Incubar a 30-37o^ C durante 4 dias.
Eschrerichia coli Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar MacConkey. Transferir para um tubo contendo agar tríplice açúcar ferro inclinado. Para isto, furar a base não inclinada com fio reto, retirar e estriar na superfície inclinada. Flambar a alça de platina. Incubar 30-35o^ C durante 24-48 horas. Flambar a alça de platina e com ela retirar uma colônia do agar MacConkey. Transferir para um tubo contendo agar inclinado citrato de Simmons, usando o método de estrias em superfície. Incubar a 30-37o^ C durante 4 dias.
Resultados
Referências
AULA PRÁTICA
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA PURIFICADA E DA ÁGUA POTÁVEL
Procedimentos
Coleta da amostra
Lavar as mãos e passar álcool 70% v/v. Realizar a sanitização da torneira onde será coletada a amostra com algodão umedecido com álcool 70% v/v. Desprezar a primeira saída de água. Identificar o erlenmeyer. ATENÇÃO: É NECESSÁRIA A ADIÇÃO DE 0,1 mL DE SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO DE SÓDIO 3% PARA CADA 120 mL DE ÁGUA COLETADA – CASO ELA CONTENHA CLORO. O VOLUME DE SOLUÇÃO DE TIOSSULFATO ADICIONADO ASSIM COMO SUA CONCENTRAÇÃO PODEM VARIAR EM FUNÇÃO DA ORIGEM DA ÁGUA CLORADA. Abrir rapidamente o erlenmeyer estéril e coletar não menos que 100mL de água potável ou 200 mL de água purificada, tendo o cuidado de não colocar a tampa do frasco sobre nenhuma superfície. Proceder à coleta rapidamente. Após a coleta, fechar rapidamente o erlenmeyer. Analisar a amostra coletada em, no máximo, 24 horas após a coleta. Caso a amostra não seja analisada dentro do prazo definido acima, ela deverá ser mantida sob refrigeração (geladeira a 4^0 C).
Análise microbiológica da água purificada
Sanitizar a bancada com algodão umedecido com álcool 70% v/v (movimentos unidirecionais). Ligar o bico de Bunsen. O erlenmeyer e os tubos utilizados sempre devem ser flambados antes e depois de abertos. Identificar os materiais com as respectivas diluições, data de análise, amostra analisada, meio de cultura utilizado e analista. Transferir 10 mL da amostra com auxílio de uma pipeta graduada para o erlenmeyer que contém 90 mL de solução salina peptonada estéril. Homogeneizar (SOLUÇÃO A). Pipetar 10,0 mL com auxílio de pipeta graduada da SOLUÇÃO A para outros dois erlenmeyers contendo 90 mL de solução salina peptonada. Homogeneizar. (IDENTIFICAR COMO SOLUÇÃO B1 E B2). Conectar o sistema de filtração à bomba de vácuo. Molhar a membrana com um pouco de solução peptonada estéril. Ligar a bomba de vácuo. Filtrar a SOLUÇÃO B. Lavar a membrana com três porções de 100 mL de água peptonada estéril.
Resultados
I - Água potável:
Diluições Contagem (UFC) Placa 1 Placa 2 100 10 -^1 10 -^2
II - Água purificada: Diluições Contagem (UFC)
agar caseína-soja agar Sabouraud-dextrose
Discussão dos resultados
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Conclusão
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Referências
