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ATIVIDADE ENZIMÁTICA
1 OBJETIVO
Compreender os significados bioquímicos da Constante de Michaelis-Menten e avaliar a atividade enzimática das enzimas bromelina e amilase em diferentes meios.
2 INTRODUÇÃO
O Trabalho Acadêmico a ser apresentado é uma análise de dois experimentos: O primeiro estudado apenas teoricamente; E o segundo executado no laboratório de Química, no dia 21/05/2010, orientados pela professora Rosemary Pimentel.
3 REVISÃO DE LITERATURA
Os organismos vivos são formados por coleções de moléculas inanimadas que interagem entre si. O objetivo básico da Bioquímica é mostrar como essas coleções de moléculas inanimadas interagem entre si, mantendo e perpetuando os organismos vivos(animados), através da químicas aplicada a um nível molecular. Para a Bioquímica, todos os organismos vivos(animados) são semelhantes em níveis moleculares e químicos. Assim, ela descreve as estruturas, mecanismos e processos químicos compartilhado por todos os seres existentes (inanimados e animados), comparando-os em termos moleculares, formulando princípios organizacionais que fundamentam a Lógica Molecular da Vida. Um dos princípios organizacionais da Bioquímica é a hierarquia molecular. Os seres vivos são constituídos por células com diferentes funções. Todas as células, por sua vez, possuem uma estrutura hierárquica semelhante: As células são divididas em complexos supramoleculares; Estes complexos são subdivididos em macromoléculas constituídas de biomoléculas, formadas a partir de subunidades monoméricas. Existem quatro principais grupos de macromoléculas: Lipídios, carboidratos, ácidos nucléicos e proteínas. “As proteínas são as macromoléculas mais abundantes nas células vivas. Elas ocorrem em todas as células e em todas as partes destas. As proteínas também ocorrem
em grande variedade; [...] as proteínas também exibem uma grande diversidade de funções biológicas , sendo os produtos finais mais importantes das vias de informação [...]. Em um sentido, são os instrumentos moleculares por meio dos quais a informação genética é expressa.” (LEIHNINGER, 2002. p. 89)
Dentre tantos papéis desempenhados pela proteína, encontra-se o de catálise. A catálise é a capacidade que um composto tem de acelerar uma reação num determinado substrato (“fonte de alimentação” da reação). As moléculas de proteínas que atuam como catalisadoras são chamadas de enzimas, ou biocatalisadores. A atividade enzimática foi estudada por Leonor Michaelis e Maus Menten, em 1913, dividindo o processo em duas etapas que podem ser descritas conforme a equação a seguir:
“[...] inicialmente a enzima se combina reversivelmente com o substrato para formar o complexo enzima- substrato, em um passo reversível relativamente rápido. [...] Em uma segunda etapa lenta, o complexo ES então se quebra liberando a enzima livre, o produto da reação, P. [...]” (LEIHNINGER, 2002. p. 199)
Além de estudar o processo envolvido durante a reação, Michaelis e Menten criaram uma constante combinando: A velocidade inicial e máxima de conversão do substrato em produto; a concentração de enzima; e a concentração do substrato na solução. Ou seja: Quando a concentração do substrato alcança a metade da velocidade máxima, encontramos a constante. Vale ressaltar que a constante de Michaelis-Menten tem como papel fundamental prever a quantidade de substrato e enzima para que a reação seja eficaz. Abaixo, segue a fórmula matemática da constante:
Km = (1)
Km: Constante de Michaelis-Menten; k1: Enzima e Substrato formando Complexo Enzima-Substrato; k2: Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Produto; k3: Reação reversível Complexo Enzima-Substrato formando Enzima e Substrato. Após observar as etapas da atividade enzimática, Michaelis e Menten criaram gráficos para identificar a posição da constante:
- Concentração de enzimas: “Quanto maior a concentração de enzimas, maior a velocidade da reação” (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 57);
- Concentração de Substrato no meio;
- Inibidores ou ativadores: “Moléculas que se ligam às enzimas, mudam sua conformação, favorecendo ou não o aumento da velocidade” (MASTOTROENI; GERN, 2008. p. 57).
4 EXPERIMENTO 1: DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELIS-
MENTEN(Km) E DA VELOCIDADE MÁXIMA(V (^) máx) PARA A INVERTASE DE LEVEDURA
O presente experimento foi estudado apenas teoricamente por carência de aparelhagem e reagentes no laboratório do núcleo de Marabá – Universidade do Estado do Pará (UEPA). Visto o impasse, os procedimentos experimentais do experimento serão apresentados juntamente com os significados bioquímicos gerais do mesmo.
4.1 MATERIAL E MÉTODOS
4.1.1 Equipamentos e Vidrarias
- Espectrofotômetro
- Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo)
- 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo)
- 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo)
- 1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo)
- Centrífuga e banho-Maria para dosagem de açúcares redutores
4.1.2 Reagentes
- 4 g de fermento prensado tipo Fleischmann
- Reagente de Somogyi
- Reagente de Nelson
- Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL)
- Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)
4.1.3 Procedimento Experimental
I) Extração da enzima
- Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga, adicionar 20 mL de água destilada e deixar em estufa a 37oC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer uma diluição de 1:100 ou 1:200 (a critério do professor).
II) Ensaio enzimático
- Pipetar os volumes (em mL) das soluções em 8 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 7, conforme indica o quadro que se segue: Tubo 0 1 2 3 4 5 6 7 Sacarose 12,5mM 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,0 2,5mL de padrão contendo Água 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0 0,5 100ug de glicose Invertase Diluída 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0, TABELA1: VALORES DE CONCENTRAÇÕES PARA AS SOLUÇÕES
- Incubar os tubos (exceto o tubo no 7) a 37oC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose, resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores), os quais podem ser determinados pela reação de Somogyi-Nelson.
III) Reação para dosagem de açúcares redutores.
- Após o período de incubação acrescentar 1 mL do reativo de Somogy (a reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu++ ou pela alcalinidade do reagente).
- Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do reativo de Nelson.
- Agitar, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada), agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.
- Registrar suas observações. TUBO (N O)
T% 530 nm
D.O. 530 nm
D.O. 530 nm
[S]* V** 1 [S]
1 V 0 0 mM — 1 2 mM 0, 2 4 mM 0,
V. Explique o que ocorre nos tubos 0 e 6 comparando os resultados obtidos no experimentos. O experimento não foi realizado na prática, por isso não foi possível observar o que ocorreria com os tubos.
5 EXPERIMENTO 2: AÇÃO ENZIMÁTICA EM CARBOIDRATOS E PROTEÍNAS
5.1 MATERIAL E MÉTODOS
5.1.1 Equipamentos e vidrarias
- Erlenmeyer;
- (^) Tubos de ensaio;
- Pipeta volumétrica;
- Béquer;
- Espátula;
- Vidro de relógio;
- Funil;
5.1.2 Reagentes
- Folha de gelatina incolor (2cm²);
- (^) Pedaços de papel crepom;
- Solução de Maisena;
- Extrato de abacaxi;
- Saliva;
- Bicarbonato;
- Vinagre;
- Água destilada.
5.1.3 Procedimento Experimental
I) Preparou-se as fontes de enzimas
- Liquidificou-se quatro fatias de abacaxi, congelou-se e descongelou-se a polpa e filtrou-se 5ml do extrato em papel de filtro;
- Coletou-se 2ml de saliva.
II) Preparou-se a fontes de substrato
- Cortou-se 6 pedaços com 2cm² de gelatina em folha, diluindo-as em 60ml de água colorada com papel crepom em 6 tubos de ensaio;
- Diluiu-se 200ml de maisena em 40ml de água num erlemneyer, levou-se ao aquecimento até que a solução levantasse as primeiras bolhas de fervura e deixou-se esfriar até a temperatura ambiente e distribuiu-se a solução em 3 tubos de ensaio.
III) Misturou-se as fontes de enzima com as fontes de substratos
- (^) Dispôs-se dos 3 primeiros tubos de ensaio contendo a água colorada com papel crepom, cada um contendo 10ml. Pipetou-se 1ml de extrato de abacaxi no primeiro tubo, 1ml de saliva no segundo tubo, 1ml de água no terceiro tubo e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;
- Dispôs-se dos 3 tubos de ensaio contendo a solução de maisena. Pipetou-se 1ml de extrato de abacaxi no primeiro tubo, 1ml de saliva no segundo tubo, 1ml de água no terceiro tubo e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;
- Dispôs-se dos 3 tubos de ensaio restantes contendo água colorada com papel crepom, cada um contendo 10ml. Pipetou-se 1ml de abacaxi em todos os 3 tubos. Logo após, pipetou-se 1ml de vinagre, uma colher rasa de bicarbonato de sódio e levou-se os três tubos ao banho-maria rapidamente por 15min com temperatura de 30ºC;
•.2. RESULTADOS E DISCUSSÕES
As enzimas utilizadas no presente experimento foram bromelina, presente no abacaxi e amilase, presente na saliva. As fontes utilizadas foram proteína, presente na gelatina, e amido, presente na maisena. Não foi encontrada gelatina em folha com a coloração vermelha. Para sanar a deficiência, a concentração de água foi colorada com papel crepom de cor vermelha. A coloração na solução foi necessária para que pudéssemos observar e comparar os resultados em relação à turbidez da amostra.
Vale ressaltar que o bom conhecimento da estrutura das enzimas e suas condições de funcionamento são de fundamental importância uma vez que a indústria farmacêutica utiliza os parâmetros de atividade enzimática para potencializar os efeitos dos medicamentos.
REFERÊNCIAL BIBLIOGRÁFICO
LEHNINGER, Albert Lester. Lehninger princípios de bioquímica/David L. Nelson, Michael M. Cox; traduzido por Arnaldo Antonio Simões, Wilson Roberto Navega Lodi. 3ed. São Paulo: SARVIER, 2002.
MARIOTTO, Juliana Ribeiro. Cinética Enzimática. Relatório acadêmico, 2006.
MASTROENI, Marcos Fábio. Bioquímica: Práticas Adaptadas/Marcos Fábio Mastroeni, Regina Maria Gern. São Paulo: Editora Atheneu, 2008.
