UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
COLEGIADO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DEISE ALESSANDRA
JANILDA MOREIRA
LARISSA RAMALHO
THÁLITA CAIRES.
RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA
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Relatório Cinética Enzimática, Notas de estudo de Farmácia
Estudo da cinética enzimática da amilase, considerando os efeitos do pH, temperatura e concentração de substrato
Tipologia: Notas de estudo
Antes de 2010
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DEISE ALESSANDRA
JANILDA MOREIRA
LARISSA RAMALHO
THÁLITA CAIRES.
RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA
CINÉTICA ENZIMÁTICA
FEIRA DE SANTANA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
COLEGIADO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DEISE ALESSANDRA
JANILDA MOREIRA
LARISSA RAMALHO
THÁLITA CAIRES.
FEIRA DE SANTANA
Cinética Enzimática
1. Objetivo Comparar a atividade enzimática em relação à temperatura, pH e concentração 2. Fundamentação Teórica Enzimas são proteínas que catalisam uma reação química específica e em sua maioria são conjugadas, estando associadas a grupos não-protéicos. Sua atividade catalítica depende da conservação da sua estrutura original e qualquer variação nessa estrutura altera significativamente sua atividade.
Uma característica comum de todas as enzimas é a presença e uma fenda em sua estrutura, formada principalmente por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos dentro dos quais se fixam o substrato. Certos resíduos de aminoácidos que são responsáveis pela interação estérica com o substrato e, portanto, pela especificidade do sistema, estão localizados nesta fenda, bem como os aminoácidos envolvidos no aspecto catalítico da reação. Na maioria dos casos estes resíduos são do tipo iônico e mais reativo. Além disso, a união dos íons precedentes da solução podem também cooperar na presença do substrato na catálise da reação.
Nesta prática será verificada a cinética enzimática da amilase salivar – uma enzima capaz de hidrolisar o amido em unidades de maltose e acrodextrinas, onde a determinação da velocidade da reação está relacionada com fatores cinéticos como: temperatura, pH e concentração de substrato e da enzima, presença de cofatores e inibidores, etc.
3. Procedimentos, Resultados e Discussão
A prática foi realizada em 3 etapas nas quais foram analisados os efeitos da temperatura, pH e concentração de substrato na cinética enzimática
3.1 Efeito da Temperatura Preparou-se uma solução de saliva 10% e desta foram adicionados 3mL em 3 tubos diferentes com identificação devida. Em outros 3 tubos também identificados preparou-se a solução de substrato contendo: 5 mL de solução de amido 2%, 1mL de NaCl 0,1M e 3,5 mL de solução tampão pH 6,5. Cada um dos tubos contendo as soluções de saliva e de substrato foram colocados em temperaturas diferentes durante 5 minutos, conforme o quadro abaixo:
Quadro 1: Tubos em temperaturas variadas Temperaturas
Solução
0ºC 38ºC 100ºC
Saliva Tubo 1a Tubo 2a Tubo 3a Substrato Tubo 1b Tubo 2b Tubo 3b
Após o tempo necessário, retirou-se 0,5 mL da solução de saliva que foram adicionados aos tubos com substrato nas temperatura correspondentes e esperou- se 2 minutos. Em seguida, dos tubos contendo a nova solução (substrato+saliva), retirou-se 2 gotas de cada tubo que foram adicionadas à outros tubos previamente preparados contendo 1mL de corante lugol. Assim, 2 gotas do tubo 1 à 0ºC foram colocadas no tubo 1 contendo lugol e desta mesma forma procedeu-se com os tubos 2 e 3 da solução de saliva+substrato. Esse instante foi considerado o tempo zero e, feito o gotejamento, os tubos principais retornaram às suas temperaturas iniciais, onde se esperou mais 2 minutos para que se iniciasse novo gotejamento em outros tubos de lugol. Na medida em que o rodízio de gotejamento intercalado em 2 minutos seguia, observava-se uma leve mudança de coloração na sequência de tubos de lugol que recebiam a solução à 38ºC. Tal observação pôde ser verificada no tubo 17 quando se atingiu o tempo de 16 minutos. A variação de cor ia de roxo escuro à azul roxeado e de azul a vinho. Essa progressão deveria seguir até se alcançar o ponto acrômico – momento em que a enzima consumiu todo o amido
minutos para que se iniciasse o rodízio de gotejamentos nos tubos de lugol, sendo o primeiro gotejamento considerado o tempo zero.
A primeira mudança de cor começou a ocorrer no tempo de 4 minutos ao se aplicar o pH 6,5 e, neste mesmo pH, o ponto acrômico foi alcançado quando se atingiu o tempo de 12 minutos. Aplicando o pH 8,0 também foi possível chegar ao ponto acrômico, contudo, num tempo mais demorado: 38 minutos. Já com o pH 2, não houve nenhuma alteração da coloração e, diante disso, parou-se o gotejamento da amostra nesse pH quando se atingiu o tempo de 18 minutos.
As diferenças observadas deve-se ao fato de que as enzimas, em sua maioria, possuem um pH característico no qual sua atividade é máxima. No caso da amilase, seu pH é relativamente neutro (ou levemente ácido), sendo por isso que o ponto acrômico foi alcançado num tempo menor quando se utilizou a amostra de pH 6,5. Acima ou abaixo desse pH ótimo a atividade enzimática se reduz, motivo pelo qual o ponto acrômico demorou mais de ser alcançado quando se utilizou a amostra de pH 8,0, e nenhuma atividade foi verificada com a aplicação do pH 2,0.
3.3 Efeito da concentração Preparou-se uma solução de saliva 10% e dela foram retiradas diferentes porções que foram colocadas em tubos previamente numerados. Também foram feitas soluções de substrato semelhante às preparadas nos experimentos anteriores, com a diferença de que a quantidade de solução tampão pH 6,5 adicionada era diferente para cada tubo de substrato, bem como a quantidade de solução de saliva adicionada. As quantidades de solução de saliva e de tampão colocados na solução se substrato são mostradas a seguir:
Quadro 1: quantidade de saliva Quadro 2: quantidade de tampão
tubos Quantidade de saliva (mL) 1 0, 2 1, 3 2, 4 0, tubos Quantidade de saliva (mL) 1 3, 2 3, 3 1,
As soluções foram colocadas em banho-maria conforme realizado anteriormente (em temperatura de 38º) e, após os 5 minutos foram retidas as quantidades devidas de solução de saliva que foram adicionadas aos tubos contendo substrato devidamente identificados. Realizado esse procedimento, esperou-se 2 minutos para se iniciar o gotejamento da solução (saliva+substrato) nos tubos de lugol, considerando o primeiro cotejamento como tempo zero. O experimento seguiu-se até se alcançar o ponto acrômico, sendo obtidos os seguintes resultados a partir da coloração obtida após a mistura da solução com lugol: Quadro 3: coloração obtida após se aplicar a amostra ao lugol
tubos
Tempo (min)
0 marrom escuro^ marrom escuro^ marrom averm.^ não se alteroua coloração de modo que não se alcançou o ponto acrômico
2 marrom avermelhado^ laranja avermelhado^ PONTO ACRÔMICO 4 marrom claro^ PONTO ACRÔMICO 6 laranja avermelhado 8 amarelo alaranjado 10 laranja amarelado 12 PONTO ACRÔMICO De acordo com os resultados, pode-se observar que o tubo 1 atingiu o ponto acrômico mais lentamente pois possuía uma menor concentração de enzima. O tubo 2 alcançou o ponto acrômico em tempo intermediário em relação aos tubos 1 e 3, sendo que este último atingiu o ponto acrômico mais rapidamente, uma vez que a concentração de enzimas era mais alta, logo, a concentração de substrato era menor. Como a solução de substrato presente no tubo 4 estava isenta de enzima (já que não foi adicionada solução de saliva), não seria possível atingir o ponto acrômico pois não havia enzimas para realizar a catálise. Observa-se então que um aumento na concentração de enzimas leva a um aumento na velocidade da reação. Contudo, o aumento nessa velocidade é
5. Referências
CAMPBELL, Mary K. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre: Artes Médicas Sul, 2000.
HOLME, David J; PECK, Hazel. Bioquímica Analítica. Zaragoza, Espanha: Editorial Acribia, 1987.
LEHNINGHER, Arthur. et al. Princípios de Bioquímica. 2 ed. São Paulo: Sarvier Editora, 1995.
ROSCOSKI, Robert. Bioquímica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1997.