Cromatografia, Notas de estudo de Química Industrial

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CONTEÚDO

• 1. Introdução
• 1. Objetivo
• 1. Material
• 1. Metodologia
• 1. Resultados e discussão
• 1. Conclusão
• Referências

1. INTRODUÇÃO

A cromatografia é um método que permite a separação, identificação e determinação de compostos com características semelhantes em uma mistura complexa. Em todas as separações, a amostra é transportada por uma fase móvel. A fase móvel é forçada a passar por uma fase estacionária imiscível fixa colocada em coluna ou em superfície sólida (HOLLER et al., 1918). Quando a fase móvel passa pela fase estacionária, os componentes da amostra são distribuídos pelas duas fases de uma maneira que casa um é retido na fase estacionária de forma seletiva, o que resulta em migrações diferencias dos compostos (COLLINS et al., 2011). Na cromatografia gasosa fase móvel utilizada é um gás inerte, denominado gás de arraste (HOLLER et al., 1918). Na cromatografia líquida, a fase móvel é um líquido, que é escolhido de acordo com o seu poder eluente (COLLINS et al., 2011). A classificação da cromatografia também pode ser feita levando-se em conta a polaridade da fase estacionária. Na cromatografia em fase normal a fase estacionaria é polar, na cromatografia em fase reversa, apolar (ZOCOLO, 2012). Os modos de separação em cromatografia são: por adsorção, quando se trata de um sólido como fase estacionária, a adsorção do soluto ocorre na interface entre o sólido e a fase móvel; por partição, quando a fase estacionária é líquida, ocorrendo por absorção ou partição; por troca iônica, onde sua fase estacionária é constituída por um suporte onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis e por exclusão, onde se baseia em um processo mecânico, a fase estacionária é uma matriz de composição inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade uniformes, possibilitando que as moléculas menores penetrem em seus poros e a fase móvel fique fora dos poros (COLLINS et al.,2011). Na cromatografia em camada delgada (CCD), a fase estacionária é espalhada sobre uma superfície planar, normalmente é sílica gel, alumina, terra diatomácea, celulose e outros. Como existe uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra, pela superfície da fase estacionária, a fase móvel deve ser escolhida cuidadosamente, levando-se em conta a natureza das substâncias químicas a serem separadas e a polaridade da fase móvel. Quando a amostra aplicada na placa é eluida e seus compostos não são incolores, é necessária a revelação da placa, esta pode ser feita utilizando-se luz UV, vapores de iodo, reveladores energéticos, aquecimento da placa e outros (COLLINS et al., 2011). O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (R (^) f), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel. (DEGANI et al., 1998).

2. OBJETIVO

Separar os componentes do pigmento do colorau utilizando cromatografia líquida em coluna e analisar suas frações obtidas pela cromatografia em camada delgada. Analisar as amostras obtidas da extração do eugenol do cravo e limoneno da casca de laranja utilizando cromatografia gasosa, além de caracterizar a composição do óleo essencial do cravo e da laranja pela espectrometria de massas.

3. MATERIAL

3.1. (^) - Materiais e regentes utilizados na cromatografia em coluna

• 3 mL de AcOEt (CH (^) 3COOCH (^) 2CH3)
• 3 mL de diclorometano (CH2Cl (^) 2)
• 8 mL de hexano (CH (^) 3(CH2) (^) 4(CH (^) 3)
• 3 tubos de ensaio com tampa
• Algodão
• Arame
• Béquer
• Colorau
• (^) Garra
• Gotejador
• Sílica gel
• Pipeta de Pasteur
• Proveta
• Régua
• Suporte universal

3.2. – Materiais e reagentes utilizados na cromatografia em camada delgada

• 2,5 mL de clorofórmio:metanol 9:1 (v/v)
• 2,5 mL de hexano:acetato de etila 8:2 (v/v)
• 2 placas de cromatografia em camada delgada
• Capilar
• Copo de vidro
• Iodo (I2)
• Lápis
• Metanol
• (^) Papel filtro
• Proveta
• Vidro de relógio

3.3. – Materiais e reagentes utilizados na cromatografia gasosa

4. METODOLOGIA

3.4. (^) – Cromatografia em coluna

Primeiramente, colocou-se uma pequena quantidade de algodão na saída da pipeta de Pasteur, com o auxílio de um arame, para impedir a passagem de partículas da fase estacionária. Em seguida, adicionou-se sílica em gel até uma altura de 5 cm. Foram dadas leves batidinhas na pipeta para empacotar a fase estacionária, então a coluna foi colocada verticalmente no suporte universal. Adicionou-se hexano à coluna, enquanto o hexano eluia, davam-se leve batidinhas. Quando o hexano já havia sido absorvido pela sílica, colocou-se 0,3 cm de colorou e mais 0,3 cm de sílica em gel sobre o mesmo. Com a coluna feita, adicionou-se 8 mL de hexano na coluna e esperou-se eluir. Como o gotejamento estava muito lento, utilizou-se um gotejador na parte superior da pipeta, fazendo pressão interna para que o líquido eluísse mais rapidamente. A fração foi coletada em um tubo de ensaio. Antes que a coluna secasse, adicionou-se 3 mL de diclorometano e foi feito o mesmo procedimento do hexano. Em seguida, repetiu-se o mesmo com o AcOEt. Os tubos foram etiquetados com F1, F2 e F3, respectivamente.

3.5. – Cromatografia em camada delgada

Primeiramente, fizeram-se as marcações em duas placas cromatográficas com lápis, 0, cm na parte inferior e 0,5 cm na parte superior e pontos (F1, F2 e F3) onde os compostos seriam colocados, como mostrado na Figura 2. Figura 2 – Placa cromatográfica

Colocou-se o capilar na fração F1 e tocou-se levemente a placa no ponto F1 para que a solução fosse transferida (Figura 3), a aplicação foi feita 10 vezes. O mesmo processo foi feito para as frações F2 e F3. A cada troca de fração, o capilar era lavado com metanol. Todo este processo foi repetido com a segunda placa.

Figura 3 – Transferência da solução para a placa

Em um copo de vidro, foi colocado 2,5 mL de hexano:acetato de etila 8:2 (v/v) e para que a saturação do sistema fosse mais eficiente, colocou-se uma tira de papel filtro. O copo foi fechado com um vidro de relógio e esperou-se que o papel fosse totalmente umidecido. Em seguida, colocou-se a placa no copo tampado (Figura 4) e deixou-se eluir até a marcação

O eugenol e o limoneno utilizados nas análises cromatográficas foram extraídos por destilação de arraste a vapor e por extrator de soxhlet, respectivamente, nas práticas anteriores de Química Orgânica 1. Para cada extrato, foi preparada uma solução contendo 1 uL do extrato em 1 mL de hexano.

4.2.1 – CG-FID

A cromatografia gasosa foi realizada em um equipamento de CG (Shimadzu GC-2010). Equipado com uma coluna capilar DB-WAX (coluna polar de Polietilenoglicol) de 30 cm de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e uma pelicula de fase estacionária de 0,25 μm. A temperatura do forno foi mantida à 50 ºC por 5 minutos e logo programada à 10 ºC/min ate 200 ºC e mantida por 5 minutos. O gás de arraste foi o nitrogênio com fluxo de 1,55 mL/min. À 250 ºC, foi injetado 1 uL da solução do eugenol. A detecção foi realizada por meio de um detector de ionização de chama (FID Flame ionization detector). Ao terminar a análise do eugenol, foi feita a análise do limoneno.

4.2.1 – CG-MS

A cromatografia gasosa foi realizada em um equipamento de CG (Shimadzu GC-17A) acoplado a um espectrômetro de massas QP5050 equipado com uma coluna capilar Rtx-WAX (coluna polar de polietilenoglicol) de 30 m de comprimentro, 0,25 mm de diâmetro interno e uma película de fase estacionária de 0,25 μm. A temperatura do forno foi mantida por 5 minutos. O gás de arraste foi o hélio com fluxo de 1,8 mL/min. À 250 ºC, foi injetado 1 uL da solução de

eugenol. Feita a analise do eugenol, realizou-se a análise do limoneno.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.7. (^) – Cromatografia em coluna Na cromatografia em coluna, as frações F1 (hexano) e F2 (diclorometano) não apresentaram coloração aparente, enquanto que a fração F3 (acetato de etila) apresentou coloração levemente amarelada. A ordem crescente de polaridade dos solventes é Hexano < Diclorometano < Acetato de Etila. O hexano é apolar, enquanto que o diclorometano e o acetato de etila são polares. Nessa fração foi utilizado acetato de etila, que é um solvente polar, então o pigmento do colorau também tem características polares.

3.8. – Cromatografia em camada delgada

Na cromatografia em coluna delgada, a utilização do hexano:acetato de etila 8:2 serviu para a verificação da existência de constituintes menos polares nos extratos e a utilização do clorofórmio:metanol 9:1, para a verificação da existência de compostos mais polares. Na placa da Figura 6, mostra-se que uma pequena parcela dos compostos foi eluída. A fração F1 não apresentou compostos apolares. Na fração F2, houve migração de compostos e na fração F3, a solução ficou concentrada no ponto mais baixo. A ordem de polaridade é F2 < F3.

Figura 6 – Placa cromatográfica com hexano:acetato de etila 8:

Cálculo dos fatores de retenção:

amostra. O primeiro pico corresponde ao solvente utilizado, o segundo e terceiro correspondem aos compostos separados.

Figura 8 - Cromatograma do Eugenol obtido na análise em CG-FID.

Sabe-se que a CG permite a realização de análises qualitativas. A análise qualitativa é baseada na velocidade com que cada componente da amostra atravessa a coluna, utilizando- se o parâmetro Tempo de Retenção. O tempo de retenção de uma substancia é o tempo gasto desde o momento em que a amostra é injetada, até o momento em ela sai do sistema cromatográfico e é detectada. O tempo de retenção especificado na Tabela 1 mostra por quanto tempo cada composto permaneceu na coluna.

Tabela 1- Tempos de Retenção obtidos na análise em CG-FID para o cromatograma da Figura 8.

Composto Tempo de Retenção (min)

1 Hexano 1. 2 Eugenol 22. 3 Não identificado 23.

O cromatograma gerado em CG-MS (Figura 9) é semelhante ao obtido na cromatografia em CG-FID.

Figura 9- Cromatograma de íons totais (TIC) do Eugenol obtido na análise em CG-MS.

Os tempos de retenção da CG-MS estão expostos na Tabela 2.

Tabela 2- Tempos de Retenção obtidos das análises em CG-MS para o cromatograma da Figura

Composto Tempo de Retenção (min)

1 Eugenol 19. 2 Acetato de Eugenol 20.

A massa da molécula do engenol é 164,20 g/mol. Nota-se um pico em 164 no espectrograma de massas do eugenol (Figura 10), esse pico representa a massa do íon molecular do eugenol. Cada pico em vermelho representa uma fragmentação da molécula do eugenol.

Figura 10- Espectro de Massas do Eugenol

5.3.2 – Análises do Limoneno

No cromatograma obtido na análise em CG-FID (Figura 11) mostra que no material extraído da casca da laranja não continha apenas o limoneno.

Figura 11 – Cromatograma do Limoneno obtido na análise em CG-FID.

Os tempos de retenção obtidos na análise em CG-FID da solução do limoneno estão expostos na Tabela 3.

Tabela 3- Tempos de Retenção obtidos na análise em CG-FID para o cromatograma da Figura 12.

Composto Tempo de Retenção (min)

1 Hexano 1. 2 Limoneno 8. 3 Não identificado 14.

O cromatograma obtido na análise em CG-MS (Figura 12) também mostra que continha outros componentes na amostra da extração do limoneno. Figura 12- Cromatograma de íons totais (TIC) do Limoneno obtido na análise em CG-MS

6. CONCLUSÃO

Através dos experimentos realizados, pode-se concluir que separações de compostos por cromatografia, seja ela em coluna, em camada delgada e a gasosa, é um método eficiente, pois os objetivos da prática foram alcançados. As cromatografias em coluna e em camada delgada podem ser utilizadas para a separação de misturas menos complexas, enquanto que a cromatografia gasosa pode ser utilizada em separações mais difíceis. A espectrometria de massas também se mostrou eficiente para a confirmação da presença do eugenol e do limoneno dos materiais extraídos nas práticas anteriores.

REFERÊNCIAS

COLLINS, C.H., BRAGA, G.L., BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia. 1ª edição. Campinas, SP: Editora da Unicamp, 2006.

DEGANI, Ana; CASS, Quezia; VIEIRA, Paulo. Cromatografia: um breve ensaio. Disponível em: < http://qnesc.sbq.org.br/online/qnesc07/atual.pdf> Acesso em: 15 set. 2014.

HOLLER, E.J; SKOOG, D.A.; CROUCH, S.R. Princípios de Análise Instrumental. 6ª edição. Porto Alegre: Bookman, 2009.

MCSHANE, J.J. What is the difference between HS-GC-FID and GC-MS. Disponível em: < http://www.thetruthaboutforensicscience.com/what-is-the-difference-between-hs-gc- fid-and-gc-ms/> Acesso em: 03 out. 2014.

ZOCOLO, G.J. Princípios e Aplicações da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Disponivel em: < http://www.crq4.org.br/sms/files/file/hplc_araraquara_2012_site.pdf> Acesso em: 15 set. 2014.