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1 - Medir o pH no intestino médio abdominal e no intestino médio torácico durante a digestão do repasto sanguíneo em fêmeas alimentadas com sangue.
Tipologia: Provas
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VÂNIA CRISTINA DOS SANTOS
Dissertação Submetida Ao Colegiado Do Programa De Pós- Graduação Em Parasitologia Do Departamento De Parasitologia - Instituto De Ciências Biológicas - Universidade Federal De Minas Gerais, Como Requisito Parcial Para Obtenção De Título De Mestre Em Parasitologia Área De Concentração: Entomologia
Orientador: Dr. NELDER DE FIGUEIREDO GONTIJO Co-orientador: Dr. MARCOS HORÁCIO PEREIRA Laboratório de Fisiologia de Insetos Hematófagos Departamento de Parasitologia - ICB - UFMG Junho - 2006
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comigo, e mesmo buscando outros caminhos na pesquisa e na biologia, ter continuado sempre contribuindo e me apoiando com carinho e amizade inestimáveis;
Fernanda (Uberlândia) e Veruska, pelos conselhos, pela solidariedade e momentos de alegria;
Flebotomíneos;
muito mais alegre e menos estressante: Vladimir, Andrezza, Rafaela, Natasha, Jéssica, Érica e Arthur; além dos que já passaram pelo laboratório: Raquel, Thelma, Dani, Artur, Warrison, Maurício, Sílvia , Reginaldo, e tantos outros;
muito a respeito de determinação, dedicação à pesquisa, e acima de tudo, a respeito de relações de amizade. Michel e Ândrey, pelos pesquisadores fantásticos que vocês são, cada um ao seu modo, admiro muito vocês!
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Tatiana, Márcia, Rose, Renatinha, Leandra, Carinão, e todos os outros com quem convivi durante o mestrado, pelos momentos felizes e de descontração e pelo apoio;
pela amizade sincera, pela torcida, e por todos os momentos vividos;
(Departamento de Bioquímica e Imunologia - ICB - UFMG), pela disponibilidade e gentileza no empréstimo de equipamentos;
contribuição na elaboração do projeto deste trabalho;
pessoa do Dr. Luciano Moreira, pela gentileza de nos ter cedido material biológico;
Linardi, pela grande oportunidade de realizar este trabalho de mestrado e pelo apoio financeiro na divulgação dos resultados em Congressos.
vii
Dedico este trabalho à pessoa que, com sua criatividade, sabedoria, e dedicação me inspira no mundo da ciência, e que me ensinou e
continua a me ensinar a fazer pesquisa. Nelder, vou ser sempre grata pelos ensinamentos e pela confiança.
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“Tenho uma teoria de que o cientista e a criança trabalham com a mesma motivação, a curiosidade. Têm que descobrir o mundo, o que é, para que serve.
Só que o cientista vai à biblioteca, separa o que não é conhecido, pesquisa o desconhecido. Mas para a criança, tudo é desconhecido. Ela mexe, abre, fuça.
‘Por que, mãe’? E tem mãe que enche o saco e fala: que menino chato, chega aqui e bagunça, mexe em tudo! Se ele vence esta repressão, ou vira cientista ou alguém com a mente indagativa, que muitos chamam de subversivo(...)”
Ângelo Machado
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4.2.2 Medidas de pH no intestino médio torácico em fêmeas com repasto sangüíneo
4.3 Verificação da distribuição da atividade da α-glicosidase no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
4.4 Verificação do possível papel da volatilização do dióxido de carbono (CO 2 ) no processo de alcalinização do intestino médio abdominal de fêmeas de Lutzomyia longipalpis alimentadas com sangue
4.4.1 Alimentação das fêmeas e medida de pH 38
4.5 Verificação da existência de manutenção ativa do pH 6,0 no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
4.5.1 Alimentação forçada 40
4.5.2 Medida do pH nas várias regiões do tubo digestivo 42
4.6 Verificação do efeito da acetazolamida no possível mecanismo ativo de controle do pH no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
4.6.1 Verificação do efeito da inibição da atividade da anidrase carbônica na alcalinização do intestino médio
4.6.2 Verificação do efeito da inibição da atividade da anidrase carbônica na acidificação do intestino médio
4.7 Verificação da presença de atividade da anidrase carbônica no intestino médio de L. longipalpis durante a digestão do repasto sanguíneo
4.8 Verificação da ocorrência de expressão de genes para a anidrase carbônica nas células do intestino médio de Lutzomyia longipalpis sem repasto sanguíneo através de RT – PCR (“Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction”)
4.8.1 Extração de RNA do intestino de Lutzomyia longipalpis 47
4.8.2 Síntese de cDNA usando oligo dT 48
4.8.3 PCR (“Polimerase Chain Reaction”) 48
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4.8.4 Controle positivo para os iniciadores do gene para anidrase carbônica e verificação da presença de seqüência(s) para a enzima no DNA de Lutzomyia longipalpis
4.9 Verificação do papel do transporte diferencial de fosfato na acidificação do pH no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem repasto sangüíneo
5.1 Medida do pH no intestino médio abdominal e no intestino médio torácico em fêmeas de Lutzomyia longipalpis com repasto sangüíneo
5.1.1 Medida do pH do intestino médio abdominal em fêmeas com repasto sangüíneo
5.1.2 Medida de pH no intestino médio torácico em fêmeas com repasto sangüíneo
5.2 (^) Distribuição da atividade da α-glicosidase no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
5.3 Papel^ da^ volatilização^ do^ dióxido^ de^ carbono^ (CO 2 )^ no^ processo^ de alcalinização do intestino médio abdominal de fêmeas de Lutzomyia longipalpis alimentadas com sangue
5.4 Ocorrência de manutenção ativa do pH 6,0 no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
5.5 Efeito da acetazolamida, inibidor da atividade da anidrase carbônica, no mecanismo ativo de controle do pH do intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem o repasto sanguíneo
5.6 Verificação da presença de atividade da anidrase carbônica no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis durante a digestão do repasto sangüíneo
5.7 Verificação da expressão de anidrase carbônica nas células do intestino médio de Lutzomyia longipalpis sem repasto sanguíneo através de RT-PCR.
5.8 Verificação do papel do transporte diferencial de um dos íons fosfato na acidificação do pH no intestino médio de fêmeas de Lutzomyia longipalpis sem repasto sangüíneo
xiii
Tabela 1 pHs alcançados pelo sangue pobre em CO 2 no intestino médio abdominal de fêmeas de Lutzomyia longipalpis
Tabela 2 pHs alcançados pelo sangue rico em CO 2 no intestino médio abdominal de fêmeas de Lutzomyia longipalpis
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Quadro 1 Ensaio enzimático da anidrase carbônica (adaptado do trabalho de Terra et al., 1988)
Quadro 2 Calibrações feitas antes e depois da medida de pH no intestino médio abdominal de uma fêmea de L. longipalpis
Quadro 3 Médias entre as calibrações anterior e posterior à medida do pH no intestino médio abdominal de L. longipalpis
Quadro 4 (^) Atividade da α - glicosidase em intestino médio torácico e intestino médio abdominal de fêmeas de L. longipalpis não alimentadas com sangue
Quadro 5 Atividade da enzima anidrase carbônica no tubo digestivo de fêmeas de L. longipalpis alimentadas com sangue
Quadro 6 Atividade da enzima anidrase carbônica no tubo digestivo de fêmeas de L. longipalpis não alimentadas com sangue
xvi
Figura 13 Freqüência de pHs observada no tubo digestivo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada do tampão MES a 40mM ou 80mM pH 5,
Figura 14 Freqüência de pHs observada no tubo digestivo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada do tampão HEPES a 40mM ou 80mM pH 7,
Figura 15 Freqüência de pHs observada no intestino médio torácico e no divertículo esofagiano de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada de tampão MES 160mM pH 5,0 com e sem acetazolamida
Figura 16 Freqüência de pHs observada no intestino médio abdominal e no divertículo esofagiano de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada de tampão MES 160mM pH 5,0 com e sem acetazolamida
Figura 17 Freqüência de pHs observada no intestino médio torácico e no divertículo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada de tampão HEPES 160mM pH 7,5 com e sem acetazolamida
Figura 18 Freqüência de pHs observada no intestino médio abdominal e no divertículo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada de tampão HEPES 160mM pH 7,5 com e sem acetazolamida
Figura 19 Produtos da RT-PCR com intestino de fêmeas de L. longipalpis sem repasto sanguíneo, utilizando os iniciadores para a anidrase carbônica de Anopheles gambiae
Figura 20 Produtos da PCR com DNA de Anopheles gambiae e Lutzomyia longipalpis utilizando os iniciadores desenhados a partir de seqüências de anidrase carbônica de A. gambiae
Figura 21 pHs no tubo digestivo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada do fosfato de potássio a 40mM pH 7,
Figura 22 pHs no tubo digestivo de fêmeas de Lutzomyia longipalpis após a ingestão forçada do HEPES a 40mM pH 7,
xvii
RESUMO
Apesar da importância do pH no desenvolvimento de Leishmania e nos processos digestivos que
ocorrem no tubo digestivo dos flebotomíneos, não há na literatura, nenhum estudo a respeito do pH
e seus mecanismos de controle no intestino médio de Lutzomyia longipalpis. No presente trabalho,
utilizamos corantes vitais indicadores de pH e microeletrodos para medir o pH das porções torácica
e abdominal do intestino médio de fêmeas de L. longipalpis durante a digestão do repasto
sanguíneo. O pH no intestino médio abdominal atinge valores iguais ou superiores a 8,0, enquanto
que no intestino médio torácico, o pH é de aproximadamente 6,0. Através de espectrofotometria, foi
observado que a atividade da enzima digestiva α-glicosidase (que digere sacarose) é cerca de 14
vezes maior no intestino médio torácico do que no intestino médio abdominal de fêmeas de L.
longipalpis, durante a digestão do repasto sanguíneo. Assim, demonstramos que a digestão do
repasto sanguíneo e dos açúcares ingeridos pelo flebotomíneo é compartimentalizada: os açúcares
são digeridos em meio ácido no intestino médio torácico, enquanto as proteínas são clivadas em
meio alcalino no intestino médio abdominal. Introduzindo soluções tamponadas MES ou HEPES
(pHs 5,0 e 7,5, respectivamente) no tubo digestivo de L. longipalpis, através de alimentação
forçada, demonstramos que o pH 6,0 do intestino médio de fêmeas não alimentadas com sangue é
mantido ativamente sem alteração. Utilizando a mesma técnica, observamos que a acetazolamida,
um inibidor da anidrase carbônica, dificulta a acidificação do intestino médio de fêmeas de L.
longipalpis, quando estas são desafiadas com uma solução tampão HEPES pH 7,5, contendo o
inibidor, mas parece não ter influência na alcalinização do meio intestinal, quando o desafio é feito
com tampão MES pH 5,0. A anidrase carbônica provavelmente participa da regulação do pH
intestinal de L. longipalpis, mas não fomos capazes de detectar por RT-PCR, o produto de
transcrição do seu gene, quando utilizamos iniciadores homólogos a anidrase carbônica de
Anopheles gambiae. Também não foi possível detectar a atividade de anidrase carbônica no tubo
digestivo de flebotomíneos com ou sem o repasto sanguíneo utilizando espectrofotometria.
Alimentando fêmeas com tampão fosfato de potássio (alimentação forçada), foi possível demonstrar
que íons fosfato não têm envolvimento direto na manutenção do pH no intestino médio de L.
longipalpis, pelo menos quando o inseto está sem o repasto sanguíneo. Alimentando fêmeas (em
alimentador artificial) com sangue humano degaseificado, observamos que a retirada do CO 2 do
sangue pode ter alguma influência na alcalinização do pH intestinal de L. longipalpis, mas
provavelmente outros mecanismos participam da alcalinização no intestino médio abdominal
durante a digestão do repasto sanguíneo.
_______________________________________________________________________________Introdução
2
diferentes hospedeiros (Mauricio et al., 2000). Ao longo do texto desta dissertação,
utilizaremos L. chagasi como sinonímia para L. infantum.
O calazar em humanos inicialmente era uma doença de ambientes silvestres ou
rurais, mas nas últimas décadas, muitos casos têm ocorrido em centros urbanos e em áreas
residenciais (Lainson e Rangel, 2005). Na América Latina, a doença já foi relatada em pelo
menos 12 países sendo que 90% dos casos ocorrem no Brasil (Deane e Grimaldi 1985;
Lainson e Rangel, 2005).
Em nosso país, a leishmaniose visceral é endêmica, com registro de surtos
freqüentes, e encontra-se em franca expansão para grandes centros. Casos autóctones já são
comumente diagnosticados em Teresina (PI), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Natal (RN), e
em outras capitais brasileiras, incluindo Belo Horizonte. Atualmente, o calazar está
distribuído em 19 Estados da Federação, atingindo quatro das cinco regiões brasileiras. Sua
maior incidência encontra-se no Nordeste, região responsável por aproximadamente 70%
do total de casos, seguido pela região Sudeste, região Norte, e região Centro-Oeste. Tem-se
registrado, em média, cerca de 3.500 casos humanos por ano, e as taxas de letalidade, de
acordo com os registros oficiais podem chegar a 10% em alguns locais (MS, 2006).
Desde os primeiros relatos da leishmaniose visceral no Brasil na década de 30, o
flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz e Neiva, 1912) tem sido
incriminado como o principal vetor de L. chagasi em nosso país e nas Américas (Chagas,
1936; Lainson et al., 1977).
_______________________________________________________________________________Introdução
3
1.1 - Aspectos da biologia e características gerais de Lutzomyia longipalpis
Os flebotomíneos são insetos holometábolos, cujo desenvolvimento a partir do ovo
passa por quatro estádios larvais e pelo estágio de pupa (Ward, 1990; Killick-Kendrick,
1999). Os criadouros de flebotomíneos na natureza são de difícil localização, mas sabe-se
que as larvas se alimentam de matéria orgânica do solo (Ferro et al., 1997), enquanto que
os adultos, machos e fêmeas, utilizam seiva de plantas, néctar de flores e secreções
açucaradas de insetos como fonte de alimentação (Chaniotis, 1974; Schlein, 1986;
Molyneux et al., 1991). Somente as fêmeas dos flebotomíneos são hematófagas, e o sangue
obtido durante o repasto sanguíneo é utilizado para a maturação dos ovaríolos. Em
espécimes de L. longipalpis criados em laboratório, a digestão do sangue no intestino dura
aproximadamente 50 horas, sendo que a oviposição é feita a partir do quinto dia após o
repasto sanguíneo. Da fase de ovo até a emergência dos adultos, se passam
aproximadamente 40 dias. Este período pode variar, dependendo das condições de criação.
Rangel et al., (1986), por exemplo, observaram um período de desenvolvimento que variou
de 28 a 36 dias para L. longipalpis e Lutzomyia intermedia criados em condições de
laboratório.
Os adultos de L. longipalpis se caracterizam pelo tamanho reduzido (entre 2,0 e
3,0mm), e pelo corpo densamente coberto de cerdas finas. As pernas e antenas são
relativamente longas e finas (Young e Duncan, 1994). Um exemplar fêmea desta espécie é
mostrado na figura 1.
