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bioinformatica
Tipologia: Notas de estudo
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ANTIBIÓTICO RIFAMPICINA A PROTEÍNA RPOB DE Mycobacterium leprae
ANTIBIÓTICO RIFAMPICINA A PROTEÍNA RPOB DE Mycobacterium leprae
Monografia apresentada como Trabalho de Conclusão do Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas, do Centro Universitário do Norte.
Orientador (a): Daniel Esteves Raid
Dedico este trabalho monográfico a minha família que são meus exemplos de vida, que sempre me apoiaram nas minhas decisões. em especial (Raimundo Ribeiro Silva e Maria Zilmar de Queiroz, Gilcilene Barroso Ferreira, Raimunda Nonata da silva Ferreira e meu Pai Valdir Ferreira de Paula).
Primeiramente a Jeová Deus por ter me dado força durante toda a jornada;
A minha família que sempre me amou, me dando apoio em tudo que precisei;
A minha esposa Gilcilene Barroso Ferreira pela paciência de eu estudar ate de madrugada.
Em especial o meu orientador, professor e amigo. Msc. Daniel Esteves Raid. Pelo empenho e paciência que me prestou o tempo inteiro para realização deste trabalho;
Também aos belos amigos que me apoiaram nesta jornada e os ótimos Professores que fizeram parte desta caminhada.
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae , causando danos severos no paciente. Sendo uma doença hiperendêmica no estado do amazonas a hanseníase já é considerada uma doença pública. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o tratamento da hanseníase é feito atraves da PQT (poliquimioterapia) que é atuação conjunta de três antibióticos (a rifampicina, ofloxacina e dapsona). Devido o tratamento não ser realizado plenamente pelo paciente e o programa de ter apenas uma cobertura do tratamento poliquimioterápico de apenas 54% no Brasil, estudos mostram que essas barreiras fazem com que alguns pacientes desenvolvam resistência ao tratamento poliquimioterápico. Uma das resistências pode acontecer devido a mutações nos três genes envolvidos na hanseníase (folP1, rpoB e gyrA) sendo que a subunidade beta da RNA polimerase (RPOB) de Mycobacterium leprae , codificada pelo gene rpoB é alvo do antibiótico rifampicina, que é o objeto de estudo deste trabalho. A proteína RPOB foi modelada utilizando a tecnica de modelagem por homologia molecular. O modelo foi produzido a partir de uma busca no banco PDB ( Protein Data Bank ) por proteínas similares que serviram como moldes. O modelo produzido foi baseado no grau de identidade entre o molde e o modelo. O modelo foi posteriormente analisado com softwares específicos de validação. Depois de validados foram feitas analise das distancia gênica das sequencias lineares e sequencia espacial e também a analise da similaridade do sitio de ligação do antibiótico rifampicina entre modelos e moldes.
Palavra Chave: Hanseníase , Mycobacterium, Gene Rpob, Rifampicina, Modelagem, Analise Evolutiva, , Analise Filogenetica
Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, causing severe damage to the patient. Being a hyperendemic disease in the state of Amazonas leprosy is now considered a disease public. According to the World Health Organization (WHO), the treatment of leprosy is done through the MDT (MDT) which is joint work of three antibiotics (rifampicin, ofloxacin and dapsone). Because the treatment has not been fully realized by the patient and the program only have a cover of chemotherapy treatment only 54% in Brazil, studies show that these barriers cause some patients develop resistance to chemotherapy treatment. One of resistance may be due to mutations in three genes involved in leprosy (folP1, rpoB and gyrA) where the RNA polymerase beta subunit (rpoB) Mycobacterium leprae, encoded by the rpoB gene is the target of the antibiotic rifampin, which is the object study of this work. The rpoB protein was modeled using the technique of molecular homology modeling. The model was produced from a search on the database PDB (Protein Data Bank) similar proteins that were used as templates. The model was produced based on the degree of identity between the mold and model. The model was further analyzed with specific software validation. Validated were made after analysis of the genetic distance of linear sequences and sequence space and also the analysis of the similarity of the binding site of the antibiotic Rifampicine between models and molds.
Keyword: Leprosy, Mycobacterium, rpoB, Rifampicin, Modeling, Analysis Evolutionary, phylogenetic analysis
Hanseníase
A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae. Afeta os nervos e a pele e que provoca danos severos. O nome hanseníase é devido ao descobridor do microrganismo causador da doença Gerhard Hansen e é ainda um importante problema de saúde em vários países da Ásia, América Latina e África (Araújo, 2003).
A doença manifesta-se em dois polos estáveis e opostos (virchowiana e tuberculóide) e dois grupos instáveis (indeterminado e dimorfo). Em outra classificação a doença é dividida em forma tuberculóide, borderline ou dimorfa que são subdivididos em dimorfa-tuberculóide, dimorfa-dimorfa e dimorfa-wirchowiana, e virchowiana (Araújo, 2003).
O Estado do Amazonas teve uma diminuição, nas duas últimas décadas sobre as taxas de prevalência da hanseníase. O que ocorre com essa taxa de prevalência de tendência descendente, acontece também com outro indicador importante que mede o comportamento epidemiológico da doença, que é o coeficiente de detecta os casos novos. No estado do amazonas passou de 154,17/100.000 hab. em 1981 para 22,78/100.000 hab. em 2008, o que representou uma redução de 85,2%, permitindo a mudança da classificação epidemiológica de hiperendêmica (> 40,0/100.000 hab.) para muito alto (40,0-20,0/100.000 hab.) desde o ano de 2003 (Boletim epidemiológico Alfredo da Matta, 2009).
Conforme o declínio das taxas de detecção da hanseníase, vários casos surgiram com recidiva a medicamentos, representando uma ameaça para o controle das doenças. Especialmente quando o tratamento é a base da quimioterapia, sendo este o principal tratamento para o controle da doença (Opromolla, et al , 1993).
Hanseníase e a resistência a medicamentos
A resistência a medicamentos tem sido relatada desde 1964 por dapsona, em 1976 para a rifampicina e em 1996 para a ofloxacina. (Ura, et al., 2007).
Como a rifampicina é a droga de principal atuação na PQT (poliquimioterapia), a Organização Mundial da Saúde (OMS) passou em 2008 a coletar informações sobre recidiva de hanseníase e em 2009 iniciou a vigilância de resistência à rifampicina e dapsona com a iniciativa Global Surveillance of Drug Resistance in Leprosy , da qual o Brasil faz parte.
Estudos mostram que existem três genes envolvidos na resistência da hanseníase: folP 1 , rpoB e gyrA. Estes genes são os responsáveis pela resistência à dapsona, rifampicina e fluoroquinolonas, onde Não é conhecida a interação espacial entre esses medicamentos e as proteínas codificadas por esses genes. (Maeda et al., 2008 e Ura, et al., 2007).
Esta análise também mensura sítios conservados, compartilhamento de aminoácido e a relações evolutivas entre as rpoB.
O aumento da resistência medicamentosa é uma grande preocupação de vários programas de controle de doenças infecciosas, tornando-se às vezes não eficaz ao paciente. Sabendo que tal resistência e o envolvimento de três genes folp1, rpoB e gyrA, que são responsáveis pela resistência à dapsona, rifampicina e fluoroquinolonas, posteriomente a análise tridimensional e evolutiva da proteina RPOB, servirá como base para estudos subsequentes sobre a resistência ao antibiotico rifampicina.
Objetivo Geral
Analisar os padrões evolutivos do sitio de interação do antibiótico rifampicina á estrutura espacial da proteína RPOB de M. leprae e organismos que possuam RPOB ortóloga
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter e comparar as sequências lineares da proteína RPOB de M. leprae e organismos que possuam RPOB ortóloga.
Modelar e validar as estruturas espaciais da proteína RPOB de M. leprae e organismos que possuam RPOB ortóloga.
Analisar a similariedade estrutural da RPOB de M. leprae e organismos que possuam RPOB ortóloga.
Comparar a similaridade linear e tridimensional das regiões de interação das proteínas RPOB de M. leprae e organismos que possuam RPOB ortóloga.
Métodos utilizados
As etapas utilizadas para a execução do devido trabalho estão resumidas na figura 01, onde é demonstrada a busca em um banco de dados PDB um molde tridimensional para fazer um alinhamento com a proteína-alvo depois de realizado o alinhamento e tendendo uma
similaridade satisfatória emprega a modelagem da proteína e por ultimo a validação da proteína tridimensional (Silva, 2010).
Busca de Sequencia alvo de M. Leprae e organismo com RPOB ortóloga no banco de dados on-line genbank.
Busca do molde tridimensional para M. leprae e organismo com RPOB ortóloga no banco de dados RCSB (PDB)
Modelagem molecular no SWISS MODEL
Validação dos modelos
Alinhamento (linear e espacial) dos modelos produzidos
Análise da similaridade linear e espacial entre modelos e molde
Análise da similaridade do sitio de ligação da rifampicina
entre modelos e Figura 01. Representação das etapas do molde projeto
1992),(Sánchez & Šali, 1998). A base para um modelo ideal é ter uma boa qualidade estereoquímica.
Os softwares mais utilizados são o VERIFY3D (Luthy et al ., 1992) sendo que Os modelos gerados foram submetidos ao servidor on-line UCLA-DOE (http:/nihserver.mbi.ucla.edu/Verify_3D), tendo como parâmetros de validação:
0,2 = 20%%, sequência considerada satisfatória
-45% analisar novamente a sequência, pois alguns ambientes químicos de algum resíduo não estão sendo reconhecidos pelos parâmetros do programa.
< ou = -45% sequência insatisfatória
O software ANOELA (Melo & Feytmans 1998), Foi ultilizado o servidor on-line SWISS MODEL para a validação dos modelos gerados, tendo como método o AMFP (potencial de força atómica média), para calcular o perfil de energia não local (NL-perfil) de uma estrutura de proteínas, sendo estes softwares responsáveis pela avaliação da qualidade estereoquímica de uma proteína.
Outro programa que geram vários gráficos de qualidade estereoquímica do modelo em comparação com a proteína alvo é o de Ramachandran, que demonstra a relação entre os ângulos torcionais da cadeia principal ( phi e psi ), onde Os modelos gerados foram submetidos ao servidor on-line Molprobity que gerou gráficos de Ramachandran tendo como parâmetros quatro regiões no gráfico como mostra a figura 03 (Lakowski, 1993) (Silva, 2008).
-Regiões permitidas (Regiões em vermelho)
-Regiões adicionalmente permitidas (Regiões em amarelo)
-Regiões generosamente permitidas (Regiões em rosa)
-Regiões proibidas (Regiões em branco)
.
Figura 02. Gráfico de Ramachandran, demonstrando a distribuição do resíduo de acordo os ângulos torcionais da cadeia principal ( phi e psi ) onde a estrutura da proteína tem que está acima dos 90% de seus resíduos nas regiões favoráveis na cor vermelha da figura.
Análise de Distância entre sequências lineares de RPOB
Foi feito o alinhamento linear que foi realizado com o algoritmo CLUSTAL X (Thompson,J.D., et al 1997) no pacote de programas BioEdit. (Hall, T., et al 1997) onde foi considerado o parâmetro padrão do alinhamento de proteínas no menu do programa.
Após o alinhamento, foi produzido um dendograma baseado no algoritmo UPGMA utilizando o programa MEGA 5.1(HÖLTJE, et al., 2003).
Também analisou-se a ancestralidade entre as sequências dos sítios de ligação a rifampicina presentes nas sequências de RPOB de micobactérias e Escherichia coli por meio da reconstrução filogenética do algoritmo de Máxima Verossimilhança (Dempster et al., 1977), (ML) do programa MEGA 5.1. Para todas as análises foram considerados os parâmetros padrões, (Hannes B, et al., (2012).
Análise de Distância entre sequências espaciais de RPOB
O alinhamento espacial foi realizado pelo algoritmo MUSTANG, presente na plataforma on-line de alinhamento múltiplo de estruturas protéicas SALIGN,( Koichiro T., et al., 1993). Sendo que foi considerado o parâmetro padrão do alinhamento de proteínas.
Após o alinhamento, foi produzido um dendograma baseado no algoritmo UPGMA utilizando o programa MEGA 5.1. Para mensurar a distancia genica, e os sítios conservados entre as proteínas RPOB.
Análise da similaridade do sitio de ligação da rifampicina entre modelos e molde
Foram realizadas análises da similaridade por meio da sobreposição dos modelos de M. leprae , da RPOB ortóloga e do molde com o intuito de analisar as regiões de interação do antibiótico rifampicina no software de análise PYMOL 1.5, utilizando as opções padrões do software, (Schroedinger, L.L.C., 2010).
Foi feito também uma análise da superfície dos modelos gerados e do molde, utilizando o comando s urface no programa PYMOL 1.5 para analisar os sítios conservados da superfície dos modelos e do molde, responsáveis pela interação do antibiótico rifampicina.
Modelagem da proteína de M. leprae e M. tuberculosis
Durante a modelagem da proteína de M. leprae e M. tuberculosis foi utilizado o molde (3lu0c), por apresentar maior confiabilidade e possuindo uma similaridade de 43,3 %, com o molde. Figura 04 e Figura 05.
Figura 04. Modelagem da Proteína de M. leprae e M. tuberculosis no servidor SWISS MODEL (http://www.rcsb.org/pdb).
Figura 05. Modelo em superposição das RPOB de micobactérias, visualizado no software PYMOL
Validação dos modelos gerados
Os modelos gerados da RPOB de micobactérias possuíram um tamanho de 1. resíduos, que foram submetidos ao servidor Molprobity para validação. os ângulos (phi) ψ / ângulo (psi) φ, apresentam 90% de seus resíduos nas regiões permitidas de acordo com a figura 06.
Figura 06. Gráfico de Ramachandran, demonstrando a distribuição dos resíduo da proteína de Mycobacterias de acordo os ângulos torcionais da cadeia principal (phi e psi) onde a estrutura da proteína tem que está acima dos 90% de seus resíduos nas regiões permitidas na cor preta.
Foram feita Análise no Verify3D para demonstrar a compatibilidade dos modelos produzidos com sua própria sequência de aminoácidos 1D , tiveram uma pontuação satisfatória, variando de 0,2 a 0,68. Figura 07.
