Relátorio de PCR e ELETROFORESE, Manuais, Projetos, Pesquisas de Genética

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

BACHARELADO EM ENGENHARIA FLORESTAL

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA FLORESTAL

MARIANE OLIVEIRA MENEZES

PCR E ELETROFORESE

RECIFE - PE

INTRODUÇÃO

Uma molécula de DNA, quando exposta a um campo elétrico, migra para o eletrodo na velocidade ou mobilidade eletroforética, proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula. A mobilidade eletroforética é também inversamente proporcional ao coeficiente friccional da molécula, que, por sua vez, é função do tamanho e forma da molécula, e da viscosidade do meio. Nessa técnica é utilizada uma cuba com dois compartimentos, eletrodos, solução salina para condução de eletricidade. Entre os compartimentos da cuba é encaixado o gel que deve ficar submerso. Pequenos poços são feitos no gel durante sua preparação com pentes. As amostras são pipetadas nesses poços. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo. A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios-suportes, tais como papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas. A eletroforese em gel de agarose é o método padrão usado par a separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não pode m ser separados por outros meios, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou por velocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada direta mente.

entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultravioleta (entre 260 e 360nm), fluorescente em vermelho alaranjado (590nm). A intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra. Este corante pode ser utilizado de 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel (uso mais frequente), no tampão da amostra a ser aplicada, ou após a corrida quando o gel é submergido em solução de EtBr.

2. Eletroforese

• Balança analítica
• Agarose
• Tampão TBE 0,5X (Tris Borato EDTA)
• Erlenmeyer e proveta
• Fomo de micro-ondas
• Cuba de eletroforese e acessórios
• Ponteiras e micropipetas Os procedimentos utilizados foram os a seguir:
• Preparação do Gel de agarose 1% (Vf = 40 mL)
• Preparação das amostras
• Aplicação das amostras., corrida do gel e visualização final dos produtos
• Tampão de carregamento
• Intercalam-te de DNA
• Amostras de PCR/DNA
• Marcador de peso
• molecular (Ladder)
• Fonte e transluminador
• UV

RESULTADOS

Reagente Inicial Final Volume (μL) 1 Tubo Volume (μL) 2 Tubo H2O 30 μL 85 μL 34,8 34 Tampão 10x 1x 5 50 MgCl2 25 mM 2 mM 4 40 dNTPs 10 mM 0,2 mM 1 10 Primers Forw. 10 μM 0,4 μM 2 20 Primers Rese. 10 μM 0,4 μM 2 20 Taq Pol 5 U/μK 1 U 0,2 2 DNA 10 ng/μL 10 ng 1 10 Total 50 μL 500 μL Tabela 2. Dados com os resultados do processo de Eletroforese RESPOSTA DO EXERCÍCIO

1. Qual o papel dos seguintes componentes: Água: Solvente universal e completar a reação Taq Pol: Responsável por adicionar os DNTPs Tampão: Manter o pH MgCl 2 : Auxiliar a reação Mix de nucleotídeos: Bases nitrogenadas Primes: Começo da reação 2. A) A banda esperada de 553 pb foi obtida? Quais os resultados mais satisfatórios? Por quê? Sim, foram muito satisfatórias pois foram as bandas que conseguimos notar. B) Qual a importância de usar um controle negativo ( possui todos os reagentes, exceto o DNA molde) na PCR? Para principalmente, conseguirmos analisar se ele não está contaminado, ou de forma geral verificar o índice de contaminante. C) Qual a vantagem o mix oferece ao pesquisador? A principal vantagem é a menor chance de cometer erros, e maior estabilidade.

REFERÊNCIA

Peter, SNUSTAD, SIMONS, Michael J. Fundamentos de Genética, 4ª edição. Guanabara Koogan, 2008.