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Relatório da aula prática de Eletroforese
Tipologia: Notas de aula
Oferta por tempo limitado
Compartilhado em 13/06/2016
4.8
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Programa de Pós-graduação em Bioengenharia - PPBE
JUNHO de 2016
A eletroforese é uma técnica bioquímica versátil, relativamente simples, rápida e de grande poder informativo. Introduzida por Tiselius em 1937, a qual foi inicialmente realizada em meio líquido, sendo posteriormente aperfeiçoada com o emprego de um meio-suporte (Hames, 1998). Na década de 1950, a técnica recebeu impulso e aperfeiçoamento, a partir dos experimentos de Smithies (1955) e de Hunter & Market (1957), havendo forte aceitação nas décadas posteriores, tornando-se indispensável nas mais diversas áreas da biologia molecular. A eletroforese é uma técnica usada para separar, e algumas vezes purificar, macromoléculas, especialmente ácidos nucleicos e proteínas, que diferem em tamanho, carga e conformação. Como tal, é uma das técnicas mais usadas em laboratórios de bioquímica e de biologia molecular (MIGUEL et al , 2002; HAMES, 1998; TREVILATTO & WERNECK, 2014). Proteínas e ácidos nucleicos são submetidos à eletroforese em matriz porosa ou “gel”. Normalmente, o gel é preparado e depositado em cubas com canaletas ou poços para serem preenchidos com as amostras. O gel é imerso em uma solução que fornece os íons para conduzir a corrente, com poder tamponante para manter o pH em faixa relativamente constante. Quando moléculas carregadas são colocadas sob um campo elétrico, elas migram para o polo positivo ou negativo, de acordo com sua carga. Diferentemente das proteínas, que podem ter carga total tanto positiva como negativa, ácidos nucleicos sempre possuem carga total negativa, em função dos grupamentos fosfato presente nessas moléculas; assim, migram sempre para o polo positivo (TREVILATTO & WERNECK, 2014). Os géis utilizados para eletroforese podem ser compostos de agarose ou de poliacrilamida, tendo cada uma delas atributos particulares úteis em diferentes situações. A agorose é um polissacarídeo extraído de algas marinhas. É normalmente usada em concentrações entre 0,5 e 2%. Quanto maior for à concentração de agarose, mais rígido é o gel. Géis de agarose tem uma faixa de separação bastante ampla, mas baixo poder de resolução. Por meio da variação de concentração de agarose, fragmentos de DNA de 200 a
A aula prática teve objetivo determinar a proteína tonina através da técnicas de eletroforese.
3. Metodologia
A aula prática foi realizada no Laboratório de Neurociência Experimental e Computacional (LANEC), localizado no Campus Dom Bosco da Universidade Federal de São João del-Rei, MG e ministrada pelo professor Ivan Carlos dos Santos aos alunos de Pós-Graduação (MSc e DSc) do Curso de Bioengenharia. O professor contou com apoio das alunas Bárbara (mestranda) e Juliana (doutoranda).
3.1. Roteiro, equipamentos necessários e soluções
3.1.1- Micropipetas, Configurações, procedimentos padrão de pipetagem.
3.1.2- Cuba eletroforética: possibilidade de correr 20 amostras por vez.
3.2. Preparação do gel
3.2.1. Acrilamida Tamponada 40%
Acrilamida _____________ 40 g Bisacrilamida___________ 0,8 g Dissolver ±50 mL em Tampão Tris-HCl 1M (ph: 8,8). Completar o volume para 100 mL e filtrar Tampão Tris-HCl 1M (pH: 8,8) – Usado na preparação do gel Tris __________________ 60.57 g H2O (qsq)_____________ 50 mL 3.2.2. Gel de corrida 12,5%
Solução acrilamida 40% _________ 2,81 mL H2O __________________________ 6.19 mL PSA __________________________ 50 μL Temed _______________________ 16 μL 3.2.3. Gel de pente 6%
Acrilamida tamponada 40% ____________ 0.45 mL H2O _____________________________ 2.55 mL PSA _____________________________ 50 μL Temed ___________________________ 16 μL
3.5.3. Solução reveladora
Água _________________ 50 mL
Ácido cítrico ____________ 12.5 μL
Formaldeído ___________ 50 μL
3.5.4. Solução de glutaraldeído (fixadora)
Glutaraldeído __________ 40 mL
Água ________________ 160 mL
3.5.5. Solução inativadora
Ácido acético _________ 500 mL
Água _______________ 50 mL
3.6. Preparação da amostra
Amostras contendo quantidades conhecidas da proteína Tonina (5μL
Depois de fervida por 3 minutos, a solução foi submetida à centrifugação e aplicadas no gel.
3.7. Procedimentos para a corrida
3.8. Revelação
Finalizado o processo de corrida, o gel foi transferido para um recipiente contendo a solução pré-fixadora durante 40 minutos, lavado por três vezes com água destilada permanecendo por cinco minutos em agitação. Após esse procedimento, o gel foi transferido para a solução fixadora de glutaraldeído e foi mantido por 30 minutos sob agitação. Novamente o gel foi lavado em água destilada por 10 vezes sendo necessários cinco minutos de agitação por cada lavagem. Posteriormente o gel foi submetido à solução de nitrato de prata por 30 minutos, realizando em seguida três lavagens com destilada sob agitação de cinco minutos cada. Finalmente o gel foi submetido à solução reveladora até o surgimento das bandas de proteínas em seguida foi colocado na solução inativadora.
HAMES, B. D. (Ed.). Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach: A Practical Approach. OUP Oxford, 1998. MIGUEL, M. P., MENEZES, L. B., ARAÚJO, E. G. Western blotting: a técnica e aplicações na pesquisa e rotina diagnóstica em medicina veterinária. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA , Centro Científico Conhecer. v.8, n.15; p.1704,
PAGANO, M. Application of electrophoresis and related methods, such as western blotting and zymography to the study of some proteins and enzymes. Analytica Chimica Acta. v.383, p.119-125, 1999. TREVILATTO, P. C.; WERNECK, R. I. Genética odontológica. São Paulo: Artes Médicas, Série Abeno: Odontologia Essencial - Parte Básica. 160 p. 2014 VESTERBERG, O. History of electrophoretic methods. Journal of Chromatography. v.20, n.480, p.3-19, 1989.
