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Relatório de Iniciação Científica
Tipologia: Provas
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Título: ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS DE PIPER SP. (2) (PIPERACEAE)
Por: Rebeca Bastos Silva
Relatório final apresentado à Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia como parte das exigências do Programa Institucional de Bolsa de Iniciação Científica (PIBIC).
Projeto: ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE EXTRATOS DE PIPER SP. (2) (PIPERACEAE)
Discente: REBECA BASTOS SILVA
Prof. Dr. RONAN BATISTA
- Orientador -
Toda planta, que é administrada de alguma forma e por qualquer via ao homem ou animal, exercendo sobre eles uma ação farmacológica qualquer, é denominada de planta medicinal [1]. O uso de plantas medicinais pela humanidade vem de longas datas, visto que a necessidade de cura dos males que afligem o corpo acompanha o homem desde os primórdios de sua existência. Já na época do descobrimento, os colonizadores observavam e anotavam o uso frequente de ervas pelos Índios, que acreditavam que o poder curativo de determinadas plantas era devido à presença de um “espírito inteligente” [2]. Hoje, com o avanço dos estudos farmacológicos e químicos, sabe-se que tais “espíritos inteligentes”, na verdade, são constituintes químicos produzidos pelos vegetais, conhecidos como “princípios ativos”, que são capazes de causar um dado efeito biológico. O Brasil é um país com uma das maiores diversidades genéticas vegetais do mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 [3], sendo, portanto, um local adequado e com amplo potencial para o estudo fitoquímico de suas espécies. Os trabalhos em fitoquímica consistem no levantamento e estudo de componentes químicos, como princípios ativos, odores, pigmentos e moléculas da parede celular. A extração dos constituintes da planta é realizada com o uso de diferents solventes sob as mais variadas condições, como tempo e temperatura de extração. Após a extração bruta, procede-se o isolamento dos diferentes constituintes do extrato bruto obtido, podendo envolver desde uma simples cristalização até separações sucessivas com partições em solventes de polaridades diferentes, seguidas de extensivas técnicas cromatográficas [4]. As aplicações destes estudos podem se ramificar para as áreas médica, farmacêutica, agrícola, taxonômica, química, dentre outras. O presente subprojeto visa o estudo fitoquímico e avaliação das atividades biológicas de extratos de Piper mollicomum kunth (Piperaceae), uma das espécies vegetais selecionadas no projeto "Ecologia química de espécies de
A espécie P. mollicomum kunth, também conhecida como Jaborandi, é uma planta heliófila, sendo típica de ambientes de borda e clareiras [5]. Planta originária dos Estados Unidos [6], foi trazida ao Brasil e é, hoje, encontrada na Amazônia e Mata Atlântica. Na medicina popular é utilizada para problemas relacionados com dor nas costas, e há pedidos de patente depositados envolvendo essa espécie na produção de cosméticos e remédios para a menopausa. Foram encontrados poucos relatos na literatura sobre estudos fitoquímicos realizados com essa espécie, destacando-se aquele que descreve o isolamento, caracterização e avaliação do potencial antifúngico dos cromenos 1 e 2 e da diidrochalcona 3 .[7]
5.1. Coleta do material vegetal As amostras de Piper mollicomun kunth foram coletadas no município de Firmino Alves – Bahia. Uma exsicata desta espécie foi depositada no Herbário da CEPLAC, em Itabuna, Ilhéus, sob o código “Piper 005”, e identificada pelo botânico Prof. Dr. André Márcio Araújo Amorim, da UESC.
5.2. Processamento do material vegetal e preparação dos extratos As partes de P. mollicomun kunth, após coletadas, foram separadas em raiz, caule e folha, e assim submetidas à secagem em estufa à temperatura de aproximadamente 55 ºC por 72 horas, seguindo-se a pulverização. As partes da planta pulverizada foram submetidas separadamente a extrações exaustivas por maceração, inicialmente em diclorometano e em seguida em metanol, sendo estes extratos posteriormente concentrados em evaporador rotatório a temperatura de 45 ºC para obtenção dos extratos diclorometânico da raiz (EDR) , do caule (EDC) e das folhas (EDF) , bem como dos respectivos extratos metanólicos da raiz ( EMR) , do caule (EMC) e das folhas (EMF). Foi reservado aproximadamente 50 mg de todos os extratos obtidos para posterior necessidade, a outra parte desses extratos foi reservado para a realização do fracionamento cromatográfico.
5.3. Fracionamento cromatográfico do extrato EDR O extrato diclorometânico das raízes de P. mollicomum kunth (EDR) de massa igual a 2,0134 g foi submetido a Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG). Para o preparo da mesma foi utilizado hexano e sílica comum, quanto aos eluentes foram utilizados hexano, acetato de etila, álcool metílico e respectivas misturas dos mesmos. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 1.
5.3.1. Fracionamento cromatográfico do agrupamento EDR-1 coletado da CCSG do EDR O agrupamento denominado EDR-1 (frações 12 -13 da CCSG do EDR ), foi submetido à coluna cromatográfica flash para melhor separação de suas substâncias, a massa de tal fração foi de 43,2 mg. Obteve-se, por sua vez, 50 frações de tal coluna, sendo hexano e acetato de etila com proporção de (90:10) o eluente utilizado para a obtenção das 36 frações iniciais e o eluente hexano e acetato de etila na proporção de (85:15) para as frações restantes. Todas as frações foram posteriormente submetidas à CCD para identificação das possíveis substâncias puras e agrupamentos necessários.
5.4. Fracionamento cromatográfico do EMR O extrato metanólico das raízes de P. mollicomum kunth (EMR) de massa igual a 732,2 mg foi submetido à Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG) , para o preparo da mesma foi utilizado acetato de etila e sílica comum. Utilizando-se, como eluentes, acetato de etila, álcool metílico e respectivas misturas dos mesmos. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 2. Foram coletadas 40 frações em frascos de vidro previamente pesados e identificados. E procedeu-se com a análise de tais amostras por CCD.
Tabela 2 – Frações obtidas da CCSG do EMR com seus respectivos eluentes. Frações Eluente Volume 1 – 9 Acetato de etila 300 ml 10 – 14 Acetato de etila – Álcool metílico (90:10) 200 ml 15 – 17 Acetato de etila – Álcool metílico (80:20) 100 ml 18 – 25 Acetato de etila – Álcool metílico (70:30) 300 ml 26 – 30 Acetato de etila – Álcool metílico (50:50) 200 ml 31 – 40 Álcool metílico 250 ml
5.5. Fracionamento cromatográfico do EMC O extrato metanólico dos caules de P. mollicomum kunth (EMC) de massa igual a 4,2939g foi submetido à Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG) , sendo eluído conforme Tabela 3. Foram coletadas 26 frações em frascos de vidro previamente pesados e rotulados. Tais frações foram analisadas por CCD.
Tabela 3 – Frações obtidas da CCSG do EMC com seus respectivos eluentes. Frações Eluente Volume 1 – 7 Acetato de etila 2 00 ml 8 – 12 Acetato de etila – Álcool metílico (90:10) 150 ml 13 – 18 Acetato de etila – Álcool metílico (80:20) 200 ml 19 – 24 Acetato de etila – Álcool metílico (50:50) 2 00 ml 25 – 26 Álcool metílico 50 ml
5.5.1. Acetilação e fracionamento cromatográfico da fração EMC-
Acetilação : A um balão de fundo redondo (50 ml) contendo a amostra (110,3mg), adicionou-se 1 ml de piridina e 1 ml de anidrido acético, sendo esta mistura mantida à temperatura ambiente, sem agitação, e ao abrigo de luz por 24 horas. Em seguida, adicionou-se gelo pilado à mistura, que, em seguida, foi diluída com acetato de etila ( 20ml) e transferida para um funil de decantação (100 ml), onde a solução orgânica foi lavada insistentemente com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, até neutralização do meio ácido, e com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (3 X 40 ml). Após secagem com sulfato de sódio anidro, a solução orgânica foi concentrada exaustivamente em evaporador rotatório (50 ºC), até completa remoção da piridina reacional e o resíduo.
5.5.2. Fracionamento cromatográfico da fração EMC-22a A fração EMC-22a originária do EMR, de massa igual a 136,2 g, foi submetido à Cromatografia em Coluna Sílica-Gel (CCSG) , para o preparo da mesma foi utilizado hexano e sílica flash. Utilizando-se, como eluentes misturas de hexano e acetato de etila, acetato de etila e álcool metílico de forma a aumentar a polaridade das misturas. A eluição procedeu-se como indicado na Tabela 4.
27 - 31 Hexano - Acetato de etila (70:30) 200 ml 32 - 34 Hexano - Acetato de etila (50:50) 100 ml 35 - 42 Hexano - Acetato de etila (30:70) 300 ml 43 - 48 Acetato de etila 200 ml 49 - 53 Acetato de etila: Álcool metílico (50:50) 200 ml 54 Álcool metílico 100 ml
5.7. Ensaios biológicos
5.7.1. Teste antioxidante A avaliação da atividade antioxidante dos extratos foi medida pelo método do DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazila [9]. Foram preparadas soluções etanólicas dos extratos a serem analisados ( EDC, EDF, EMC , EMR e EMF ) em uma concentração de 1mg/mL. A partir destas soluções foram feitas diluições nas concentrações de 500, 250, 125, 50, 25, 10 e 5 μg/mL, a titulo de comparação foi medida a atividade antioxidante do Ácido ascórbico (padrão), diluído em etanol nas mesmas concentrações (500 – 5) μg/mL. Para o ensaio, 4 mL de cada solução dos extratos e do padrão foram misturados com 1 mL de solução metanólica 0,2 mM de DPPH. A mistura foi agitada e mantida por 30 min. ao abrigo de luz e à temperatura ambiente. Após este período de reação, as leituras das absorbâncias foram realizadas em 517 nm. Para análise, também foi feita uma amostra controle, contendo 4 mL de Etanol, onde foi acrescida de 1 mL da solução de DPPH, com o intuito de observar qualquer tipo de redução do DPPH que não fosse decorrente da ação dos extratos ou do ácido ascórbico. Todo o ensaio foi realizado em triplicata. [10] O percentual de seqüestro de radicais (%SRL) foi medido pela equação 1 [11] de acordo com as diferenças de absorção do DPPH de cada amostra ou do padrão (absA) com a absorbância da amostra ou do controle (absC).
Equação 1
5.7.2. Avaliação da atividade citotóxica contra Artemia salina Foi realizado o bioensaio de toxidade em Artêmia Salina com cinco extratos brutos de P. mollicomum kunth: EDC, EDF, EMC , EMR e EMF. O teste de atividade citotóxica contra A. salina é um ensaio preliminar, e um resultado positivo nesse teste indica uma atividade potencialmente antitumoral e/ou tripanossomicida do extrato [12]. A atividade citotóxica é medida através do número indivíduos mortos e vivos de A. salina , a uma determinada concentração de extrato. 5.7.3. Ensaio antifúngico A técnica de Bioautografia para detecção de atividade antifúngica consiste na nebulização de suspensões dos fungos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (concentração 5 x 107 esporos/mL em solução de glicose e sais) em placas de CCDC contendo 400 μg dos extratos brutos e 100 μg das substâncias puras, previamente eluídas com solvente adequado. Em seguida, as placas são incubadas em câmara úmida a 25 oC por 48 h. O aparecimento de zonas de inibição na placa nebulizada com C. sphaerospermum e/ou C. cladosporioides indica a presença de substância(s) com potencial antifúngico. A nistatina foi à substância utilizada como antifúngico padrão. Os resultados são expressos como valores de concentração da amostra (10 μg/μL) requeridos para produzir um halo de inibição comparável com o produzido pelo padrão nistatina. Os ensaios foram realizados em diferentes concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 μg/μL) para as substâncias puras e para o padrão. [13]
Figura 1 – Esquema do fracionamento das raízes e caules de P. mollicomun kunth.
6.2. Ensaios Biológicos
6.2.1. Ensaio antioxidante A atividade antioxidante envolve o potencial de neutralizar radicais livres, responsáveis por uma série de efeitos no corpo humano como o envelhecimento precoce e alguns tipos de câncer [14]. Os extratos analisados apresentaram IC 50 com valores respectivos de 111,88 μg/mol para o EMR , 108,03 μg/mol para o EMC , 106,47 μg/mol para o EMF , 223,28 μg/mol para o EDF e não foi encontrado para o EDC , como apresentado na figura 2. Para efeito de comparação, o ácido ascórbico, um potente antioxidante natural, apresentou o valor de IC 50 = 7,62 μg/mL segundo a literatura [14]. Logo se pode concluir que os extratos brutos de Piper mollicomum kunth analisados apresenta uma atividade antioxidante baixa, quando comparado com substâncias com alto potencial redutor. Este fato se deve provavelmente aos extratos brutos apresentarem grande quantidade de impurezas e clorofila, o que pode ter influenciado negativamente na maior atividade oxidante de alguns substâncias contidas nestes.
Figura 2. Gráficos mostrando o desempenho antioxidante dos extratos EMR, EMC, EMF, EDC e EDF.
6.2.3. Avaliação da atividade antifúngica contra C. cladosporioides e C. sphaerospermum As amostras isoladas DR05 (m=164,1 mg), DR12 (m= 5,9 mg), MR (m=20,2mg), MR03 (m=14,3 mg), MR04 (m= 49,8 mg), MR05 (m= 150,3 mg), foram submetidas a avaliação da atividade antifúngica através da técnica de Bioautografia. Apenas a amostra DR05 mostrou atividade frente às linhagens Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum , como é possível observar na tabela 11 e figura 2.
Tabela 11. Avaliação quantitativa de atividade antifúngica das amostras C. cladosporioides C. sphaerospermum
Conc.
100 μg/ mL
50 μg/m L
25 μg/m L
10 μg/m L
5 μg/m L
1 μg/m L
100 μg/m L
50 μg/m L
25 μg/m L
10 μg/m L
5 μg/m L
1 μg/m L DR (Rebeca
MR (Rebeca
MR (Rebeca
Legenda : * = Atividade fraca ** = Atividade média *** = Atividade forte
Figura 2. Ensaio antifúngico
