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TEMA 15. Control de los microorganismos. Agentes Físicos
Profa. Ana María Otero Casal
- Definición de conceptos: esterilización, desinfección, antisepsia, etc.
- Factores que influyen en la acción antimicrobiana
- Modos de acción de los agentes antimicrobianos.
- Control por agentes físicos: Temperatura Radiaciones Filtración Agentes químicos esterilizantes
1. Definición de conceptos.
Agente antimicrobiano: término genérico que se utiliza para denominar aquellos agentes tanto físicos como químicos que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos. Cuando se considera una acción específica contra un grupo microbiano se utilizan los términos antibacteriano, antiviral, o antifúngico. Agente microbiostático. Aquellos agentes antimicrobianos que inhiben el crecimiento de los microorganismos. Se clasifican en bacteriostáticos, virustáticos y fungistáticos. Agente microbicida/germicida: aquellos agentes antimicrobianos que causan la muerte del microorganismo. Se clasifican en bactericidas, virucidas, algicidas y fungicidas. Esterilización: eliminación de TODOS los organismos presentes en un material, incluidas las esporas y otros agentes infecciosos. Este término se utilizan para objetos inanimados. Desinfección. Destrucción o eliminación de las formas vegetativas de patógenos, pero no de las endosporas bacterianas. Su objetivo es eliminar los microorganismos potencialmente causantes de enfermedades, pero también reduce la población total microbiana. Se utiliza solo para objetos inanimados Antisepsis. Utilización de agentes antimicrobianos químicos para la eliminación de formas vegetativas de patógenos de tejidos superficiales. Quimioterapia. Antimicrobianos químicos utilizados para eliminar o inhibir el crecimiento microbiano en el interior de tejidos.
2. Factores que influyen en la acción antimicrobiana
Algunas de las variables que afectan a la efectividad de un agente antimicrobiano son:
1. Tamaño de la población. Las poblaciones menores mueren más rápidamente que las más densas, debido a la cinética logarítmica de la muerte celular (Para ampliar este concepto consultar la sección de efecto de la temperatura más abajo). 2. Intensidad o concentración del agente antimicrobiano. Cuanto menor la concentración o intensidad, mayor el tiempo necesario para eliminar la población. **3. El tiempo de exposición al agente antimicrobiano.
- La temperatura** a la que el microorganismo se encuentra cuando se expone al agente antimicrobiano. En general, mayores temperaturas incrementan la eficiencia. 5. La naturaleza del material a tratar. Por ejemplo cuando se trata de esterilizar un líquido mediante calor, a mayor viscosidad del líquido menor eficiencia del tratamiento, mientras que el pH ácido favorece la efectividad. La presencia de materia orgánica disminuye la eficiencia de muchos desinfectantes químicos, por lo que es recomendable el lavado del material antes de la desinfección o esterilización. 6. Las características de los microorganismos presentes. Existen variaciones importantes en cuanto a la resistencia a distintos agentes antimicrobianos entre distintos grupos bacterianos. En general las bacterias Gram-positivas son más resistentes al calor, mientras que algunos antimicrobianos químicos son más efectivos sobre Gram-positivas. La “edad” de las bacterias afecta también a su sensibilidad: una población que está creciendo exponencialmente suele ser menos resistente que una en fase estacionaria.
3. Modos de acción de los agentes antimicrobianos.
Los posibles mecanismos de acción de los agentes antimicrobanos están ligados a la producción de daños en las principales estructuras celulares. En el caso de las bacterias, estos cambios incluyen: Alteración del estado físico coloidal del citoplasma Inactivación de enzimas Alteración de la estructura de la membrana celular y/o pared celular, afectando al transporte de sustancias y la actividad metabólica en el primer caso y a la protección contra la presión osmótica extracelular en el segundo.
4. Control por agentes físicos
El calor y otros agentes físicos se utilizan normalmente para controlar el crecimiento microbiano y esterilizar objetos y medios de cultivo. Los cuatro métodos físicos más frecuentes son la utilización de Elevadas temperaturas, bajas temperaturas, filtración y radiación. Existen algunos agentes químicos como el óxido de etileno o el glutaraldehido que eliminan esporas y por lo
temperature ) se realiza a 135ºC durante 2-5 segundos o a 141ºC durante 2 segundos. Estos tratamientos no alteran las características organolépticas de la leche y son más eficaces al destruir todos los patógenos presentes. Una alternativa menos utilizada es la pasteurización baja en la que el líquido se calienta a 62,8ºC durante 30 minutos. Este tratamiento es menos efectivo ya que no destruye el agente de la fiebre Q ( Coxiella burnetti ). La estudio de la cinética de la esterilización por calor es importante para el establecimiento de protocolos de esterilización en la industria. Tal y como se vio en el tema de Crecimiento microbiano cuando estudiamos la curva de crecimiento de una población bacteriana, la muerte de una población bacteriana es una función exponencial de primer orden, lo que implica que a cualquier tiempo la tasa de muerte es proporcional a la concentración de microorganismos en ese tiempo, o lo que es lo mismo, el tiempo necesario para que una fracción determinada de las células muera es constante para una temperatura dada e independiente de la concentración celular inicial. Debido a esta cinética exponencial, al igual que ocurre con el crecimiento exponencial, la muerte celular se suele representar en gráficas semilogarítmicas. Estas gráficas permiten calcular el denominado Tiempo de reducción decimal (D) que es el tiempo que se requiere para reducir 10 veces la densidad de población bacteriana a una determinada temperatura. Por otro lado, la cinética de muerte celular es dependiente de la temperatura, siendo mayor el tiempo necesario para matar una población bacteriana cuanto menor sea la temperatura aplicada.
4.1.2. Calor seco. Es menos efectivo que el calor húmedo, necesitándose temperaturas más elevadas para matar a los microorganismos. Se utiliza principalmente para la esterilización de material de vidrio (placas petri no deshechables, pipetas, etc.) y metal, y en
Efecto de la temperatura sobre la viabilidad de una población bacteriana mesófila. Se observa que el tiempo de muerte poblacional se incrementa al descender la temperatura. El cálculo de D para una temperatura determinada se realiza calculando el tiempo de exposición necesario para que sólo un 10% de la población original sea viable. En el caso de la gráfica se muestra el tiempo necesario para reducir la población de 100 a 10 log, siendo D igual a 3, 12 y 42 minutos para las temperaturas de 70, 60 y 50ºC respectivamente. Gráfica tomada de Madigan et al. 2004. Brock Biología de los Microorganismos.
algunos casos se utiliza para esterilizar polvos, aceites y compuestos similares. Se utilizan hornos de esterilización y requiere un tiempo de exposición largo para la esterilización completa: 2 horas a 160ºC o 1 hora a 180ºC. La muerte celular se produce debido a la oxidación de los componentes celulares y desnaturalización de proteínas. Una alternativa de esterilización con calor seco es la incineración, que se utiliza para la destrucción en incineradores especiales de material hospitalario contaminado, animales de experimentación, etc. En el laboratorio de microbiología la incineración se utiliza para la esterilización de las asas de siembra metálicas antes y después de ponerlas en contacto con los cultivos. El calentamiento de las asas de cultivos con la llama de los mecheros Bunsen puede producir la diseminación de cultivos al hervir el líquido contenido en el asa, despidiéndo pequeñas gotas. Este problema puede solventarse utilizando pequeños incineradores eléctricos cerrados.
4.2 Frío
A pesar de que algunas bacterias pueden crecer a 0ºC, temperaturas pro debajo de 0ºC inhiben el metabolismo de numerosos microorganismos. La congelación se utiliza en la industria para la conservación de alimentos y en el laboratorio para almacenar fármacos, compuestos orgánicos o muestras que podrían verse alteradas por el crecimiento microbiano. Para ello es suficiente la congelación a -20ºC. Debido a que la congelación no mata los microorganismos sino que solamente detiene su crecimiento, es también es un método utilizado para la preservación de cepas microbianas de forma indefinida. Los cultivos se congelan a -70ºC o en nitrógeno líquido a -196ºC, de forma que se impide la contaminación con otros microorganismos y se evita la aparición de mutaciones común en los cultivos mantenidos mediante resiembra durante periodos largos.
4.3 Radiaciones.
Entre las radiaciones de elevada energía utilizadas para la esterilización de material en Microbiología distinguimos entre radiaciones no ionizantes (ultravioleta) e ionizantes (rayos X, rayos gamma). Radiaciones no ionizantes. La radiación ultravioleta, con longitud de onda entre 136 y 400 nm no produce ionización al incidir sobre una molécula, pero sí excitación de sus electrones, haciendo que reaccione de forma anómala. La radiación UV es absorbida por numerosos compuestos intracelulares, especialmente el DNA, que puede verse seriamente dañado. La acción bactericida más efectiva se produce a 260 nm, que es el máximo de absorción del DNA. Al incidir la radiación UV sobre el DNA se forman dímeros de pirimidina, de forma que dos pirimidinas contiguas en la misma cadena se unen mediante puentes. Si estos enlaces anómalos no son corregidos se originarán errores de lectura y replicación, originando mutaciones o muerte celular. Debido a que es filtrada al atravesar la atmósfera, la mayor parte de la radiación ultravioleta que nos llega del sol tiene una longitud de onda mayor de 296 nm, por lo que la exposición a luz solar no tiene efecto bactericida, aunque si parece estar
Un tipo de filtros específicos denominados filtros de aire particulado de alta eficiencia ( high- efficiency particulate air, HEPA ) se utilizan en las cabinas de flujo laminar y de seguridad biológica. Estos filtros son unos filtros de profundidad que permiten eliminar el 99,9% de las partículas de 0,3 μm presentes en el aire. En las cabinas de flujo laminar el aire es forzado a través de un filtro HEPA proyectándose una vez estéril en forma de cortina vertical en la ventana de la cabina, impidiendo la contaminación del operador y el laboratorio, además de proporcionar un espacio estéril para el manejo de muestras, siembra de cultivos, preparación de medios, etc.
4.5. Esterilización mediante agentes químicos.
La mayor parte de los agentes químicos antimicrobianos son utilizados en la desinfección no destruye las esporas y por lo tanto no son esterilizantes. Existen sin embargo algunos agentes químicos como el óxido de etileno o el glutaraldehido que sí eliminan esporas y por lo tanto deben clasificarse dentro de los agentes esterilizantes. Estos compuestos se tratarán en el Tema 11.
Bibliografía
Madigan, M.T., Martinko, J.M. Parker, J. 2004. Brock Biología de los microorganismos. 10ª Edición. Pearson Prentice Hall. Madrid. Willey, J.M., Sherwood, L.M., Woolverton, C.J. 2007. Prescott, Harley ad Klein’s Microbiology. McGraw-Hill Higher Education. Boston.
