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TEMA 3 : CROMATOGRAFÍA.
Esta técnica consiste en el método de separación de moléculas de una mezcla, disueltas en una fase móvil que se va desplazando a través de una fase estacionaria. Diferenciamos dos fases:
- Fase móvil : se desplaza durante la cromatografía.
- Fase estacionaria : no se desplaza. Teóricamente es una TÉCNICA PREPARATIVA ya que consiste en separar moléculas, aunque veremos excepciones. A veces la fase estacionaria esta colocada sobre una partícula inerte, un soporte o lecho cromatográfico. El perfil de elución es el resultado después de medir las fracciones por un espectrofotómetro , normalmente. En el laboratorio se realiza de forma automática mediante una bomba peristáltica que lo que provoca es un efecto de presión negativa haciendo que se forme una especie de succión para garantizar que todo el sistema funcione automáticamente. Incluso puedes regular esta fuerza de succión pudiendo llegar hasta valores por debajo de la velocidad de la gravedad.
Cromatografía convencional
Medida de la concentración de las moléculas (normalmente por espectroscopia) Volumen de elución de un tippo de molécula: Volumen de fase móvil a la cuál la molécula abandona la columna
al
CROMATOGRAFÍA:
MétodoMétodo dede separaciónseparación dede moléculasmoléculas (P(P 1 , PP 2 )) diferentediferente distribucióndistribución en dos fases: Fase móvil (que se desplaza durante la cromatografía) y fase estacionaria (no se desplaza) Animación Fase móvil Fase estacionaria _ _ _ (^) __ _ _ _ P 1 P 2
2 Tipos de cromatografías Interacción Tipo de cromatografía Fase estacionaria Tamaño Gel filtración Electrostática Intercambio iónico Aniónica/catiónica Hidrofóbica Interacción Hidrofóbica Polar/apolar Afinidad biológica Afinidad
1. GEL FILTRACIÓN O DE PENETRABILIDAD: Distribución dependiendo de una mayor o menor penetrabilidad de las moléculas dentro de un gel reticulado y que las separa según el tamaño que ocupa la molécula y, en extensión, según su peso molecular. La fase estacionaria es el LÍQUIDO que está dentro de las bolas que están llenas de agujeros (lecho cromatográfico). Esto permite que se generen dos espacios: Uno alrededor de la partícula. Y otro por dentro de la partícula. Hay algunas partículas capaces de penetrar por estas aberturas y otras que no. Las que no pasan por los poros, saldrán antes por el líquido que hay entre las bolas (corresponden a las de mayor peso). Este tipo de cromatografía es la única donde la fase estacionaria es líquida. Cromatografía de Penetrabilidad o gel filtración Poros de las partículas (p)Poros de las partículas (p) Intervalo de fraccionamiento: a>p>b Solutos >a no entran
Aplicaciones: A. Separación de moléculas por diferentes tamaños en condiciones nativas (tal y como estaba en la célula, sin necesidad de desnaturalizarla). Ayuda a separar los agregados de los monómeros. B. Desalado de muestras : Por ejemplo, si tenemos una muestra A en una disolución de ClMg 3mM y queremos pasarla a otra disolución de ClNa 1mM, utilizamos un gel filtración para poder cambiar de disolvente. Nuestra proteína A debe ser más grande que el diámetro del poro más grande, por lo que saldrá en el volumen vacío (primero). La solución en la que tenemos la columna es ClNa 1mM para equilibrar la columna. Cuando colocamos la solución de ClMg con la proteína, rápidamente la proteína saldrá al ser más grande que los poros y el ClMg, como es una sal muy pequeña, entraría por los poros saliendo en el volumen total. C. Pureza : Si este pico sale simétrico, significa que no existe contaminación, mientras que sale con un pico irregular significa que está impura o contaminada. D. Cálculo de masas moleculares en condiciones nativas. En este caso, una cromatografía no es solamente una técnica preparativa, SINO ANALÍTICA. Para el cálculo de masas moleculares, suponemos que tenemos unas proteínas patrón que tienen que tener la misma forma que nuestra proteína problema (normalmente globulares). Utilizamos un intervalo de fraccionamiento que nos permita separar las diferentes partículas. Hay una relación directa entre el Log de la masa y el volumen de elusión. Cuando mayor es la masa, menor es el volumen de elusión ya que saldrá primero. Con las proteínas patrones, podemos trazar una recta de regresión para poder determinar nuestra proteína problema. No se puede establecer esta relación si nuestra proteína problema sale en el volumen de vacío o en el volumen total. AA plili caciiones: ¾ Separación de moléculas de condiciones nativas (ex: agrega ¾ Desalado de muestras o cam ¾¾ PPureza ¾ Cálculo de Masas moleculare
Técnicas Instrumentales Bioquímica Tema 3 El coeficiente de repartimiento se utiliza para eliminar el factor físico de las columnas (por ejemplo, las proteínas patrón las colocamos en una columna más grande mientras que la problema la colocamos en una columna menor). El diámetro de la partícula es el diámetro de la partícula que es porosa (es muy importante para determinar la resolución de la cromatografía. Los picos muy estrechos significa que nuestro soluto sale más concentrado), mientras que el intervalo de fraccionamiento es el diámetro de los poros de la partícula. El tipo de matriz puede ser de biogel (es el más inerte de todos), sepharosa, sephadex o ultragel. A la hora de comprar una columna de cromatografía, es importante, tener en cuenta el intervalo de fraccionamiento, que nos determinará las moléculas que podemos separar (se expresa en kDa), y el diámetro de las partículas (μm), que determina la resolución de la cromatografía.
Cálculo de masa moleculares
Coeficie
KKav
culares
Cromatografía de Penetrabilidad
Coeficiente de reparto:
Ve V 0
K
av
t
K
V V
pH < pI → proteína +
pH > pI → proteína −
Para poder liberar las proteínas retenidas, podemos cambiar o la fuerza iónica o el pH. Tipos de elusión: A. Isocrática : Siempre utilizas la misma fase móvil para todo (típica del gel filtración). B. Escalonada o gradiente discontinua : ir añadiendo poco a poco Na+ para ir cambiando la fuerza iónica (por ejemplo, de 10 en 10ml). Cambia de manera discontinua. C. Gradiente continuo : concentración continuamente creciente en el tiempo. Es el mejor ya que te separa los diferentes picos cuando en la anterior lo veías en uno. Para poder separar los picos lo que se hace es hacer la pendiente de la línea mas suave. Si en vez de llegar a 100% de fuerza iónica, se llega al 50 % utilizando los mismo ml, haces que se suavice la pendiente.
TIPOS DE ELUCI ÓÓN
ISOCRÁTICA ESCALONADA O
GRADIENTEGRADIENTE
DISCONTINUO
(el tampón cambia de
manera discontinua)manera discontinua)
TIPOS DE ELUCI ÓÓN
ISOCRÁTICA ESCALONADA O
GRADIENTE
GRADIENTE
GRADIENTE CONTINUO
DISCONTINUO
(el tampón cambia de
manera discontinua)
CONTINUO
(mismo tampón
pero en
manera discontinua) concentraciónconcentración
continuamente
creciente)
E ELUCI ÓÓN
TICA ESCALONADA O
GRADIENTE
GRADIENTE
GRADIENTE CONTINUO
DISCONTINUO
(el tampón cambia de manera discontinua)
CONTINUO
(mismo tampón pero en manera discontinua) concentraciónconcentración continuamente creciente)
Otra manera para hace que la pendiente baje es aumentar el número de ml del volumen total (subes la sal de 0 a 100 en 200ml en vez de en 100ml). Aplicación para separar proteínas : Proteínas con pI muy próximos: Para separar proteínas con pI muy similares, no funciona cambiando el pH, la mejor estrategia es utilizar un cambio de fuerza iónica. Lo primero que tienes que tener en cuenta, es coger el tipo de prueba que vas a utilizar, por ejemplo, catiónica, es decir, que las proteínas estén cargadas positivamente por lo que tendrás que tener en cuenta el pH para que esté por debajo del pI. Por ejemplo, si queremos separar proteínas con pI de 5, 6 y 7 utilizando un pH de 3, la que más tarde salga será la que esté más alejada del pH ya que estará cargada más positivamente que las otras, en este caso la de pI=7. Es una elusión por orden creciente de pI. Proteínas con pI muy separados: Varias el pH de forma discontinua para ir separando proteínas de una en una. Ejemplo, proteínas con pI de 4, 6 y 8. Si empezamos con un pH de 3, estarán todas unidas. Si cambiamos el pH y lo ponemos a 5, la de pI=4 cambiará de carga de + a – por lo que saldrá mientras que las otras dos seguirán atrapadas. Y así sucesivamente hasta tener las tres separadas. EJEMPLO MEZCLA PROTEÍNAS Cromatografía cationica pI próximos^ pI diferentes Cromatografía cationica^ Cromatografia cationica pH de elución <pI Cromatografia cationica pI (a) <<pI (b)< <pI (c) Elución por gradiente de fuerza iónica Elución por orden creciente de pI Elución en tampón discon pH F Mobil 1: pI (a) < pHF. Mobil 1: pI (a) < pHFM1FM1 < p< p F. Movil 2: pI (b) < pHFM2 < p F Movil 3: pI (c) < pHF. Movil 3: pI (c) < pHFM3FM c (^) c a b a b c EJEMPLO MEZCLA PROTEÍNAS
rafía cationica
próximos^ pI diferentes rafía cationica^ Cromatografia cationica
ión <pI Cromatografia cationica pI (a) <<pI (b)< <pI (c) r gradiente de fuerza iónica r orden creciente de pI Elución en tampón discontinuo variando el pH F Mobil 1: pI (a) < pHF. Mobil 1: pI (a) < pHFM1FM1 < pI (b) < pI (c)< pI (b) < pI (c) F. Movil 2: pI (b) < pHFM2 < pI (c) F Movil 3: pI (c) < pHF. Movil 3: pI (c) < pHFM3FM c (^) c b a b c
gradiente decreciente de fuerza iónica , se van desfavoreciendo dichas uniones hidrofóbicas, por lo que las moléculas unidas van eluyendo. De este modo, el equilibrio de unión entre las moléculas de la muestra y la fase estacionaria estará determinado por la apolaridad de la molécula, la concentración de determinados iones y la presencia de moléculas que compitan por unirse a la fase estacionaria, como detergentes.
4. AFINIDAD: La técnica se basa en una interacción de reconocimiento biológico entre macromoléculas. Ejemplos: antígeno/anticuerpo, hormona/ receptor…). De esta manera, la cromatografía de afinidad se basa en anclar covalentemente a un soporte cromatográfico uno de los componentes de tales sistemas biológicos. Si el segundo componente viaja en la fase móvil, y ambos están funcionalmente activos, se producirá su unión específica, con lo que quedará retenido en la columna. Así, se pueden purificar biomoléculas a partir de mezclas muy complejas. Etapas de preparación de la fase estacionaria: 1. Activación del soporte cromatográfico inerte mediante una reacción de componentes orgánicos apareciendo preferentemente grupos hidroxilos. 2. Unión del brazo espaciador : cadena carbonada 3. Unión del ligando : es lo que interacciona con nuestra molécula por afinidad biológica.
Ejemplos de Interacción basados en afinidad biológica:
- Antígeno / Anticuerpo
- Hormona / Receptor
- Enzimas/ substratos/inhibidores/cofactores
- IMACIMAC (I(I mmobilibili zed M t l Affi itd Metal Affinit y ChCh romatt ographh y ))
- Cromatografia afinidad oligo-dt Unión de un ligando a una matriz de agarosa para la cromaUnión de un ligando a una matriz de agarosa para la croma ETAPAS DE PREPARACIÓN: 9 ACTIVACIÓN DEL SOPORTE (formación de grupos reactivos) 9 UNIÓN BRAZO ESPACIADOR (cadena carbonada)UNIÓN BRAZO ESPACIADOR (cadena carbonada) 9 UNIÓN DEL LIGANDO (grupo que interacciona por afinidad biológica)
Técnicas Instrumentales Bioquímica Tema 3 No es lo mismo una unión con carga que una afinidad por forma. El brazo espaciador lo que hace es que deja el ligando más accesible a la molécula para que se pueda reconocer mejor. Etapas de una cromatografía de afinidad: En las otras cromatografías siempre intentamos separar las moléculas, es este caso solo queremos purificar una molécula. Primero cargamos toda nuestra muestra con muchas moléculas. En nuestro soporte solo se unirá la que queremos separar, por lo que el resto de moléculas salen todas juntas haciendo que se vea un pico bastante amplio. Una vez que todas las proteínas que no se han enganchado a la columna hayan salido, comenzaremos a separar nuestra molécula por lo que en la elución solo se observa un pico que corresponde a nuestra molécula. En las otras cromatografías, en la elución se observan varios picos, en esta, desde que comienza la elución, solo se observa un pico. Cuando terminas, normalmente se vuelve a equilibrar la columna para que se pueda volver a utilizar ya que hacer una cuesta mucho. ¿Cómo separamos nuestra molécula del ligando?
1. Elución inespecífica
A. Presencia de agentes desnaturalizantes , el problema es que purificas la proteína pero es una situación que solo se utiliza a la desesperada ya que se quita la conformación de la proteína. B. Alteración de variables que afectan a la interacción con el ligando (pH…). un n ligando a una matriz de agarosa para la cromatografía de afinidad: ligando a una matriz de agarosa para la cromatografía de afinidad: EPARACIÓN: DEL SOPORTE (formación de grupos reactivos) O ESPACIADOR (cadena carbonada) ESPACIADOR (cadena carbonada) LIGANDO (grupo que interacciona por afinidad biológica)
Ejemplo de elución específica por competencia con un análogo a la molécula (IMAC). La cadena lateral de la histidina reconoce y forma enlaces coordinados con el níquel o cobre. Todas las proteínas que sean ricas en histidina quedarán unidas. Este ejemplo se utiliza en caso de bacterias colocando en un plásmido un vector que posee una cola de nucleótidos que codificarán para 6 o 9 histidinas produciéndose proteínas con cola de histidinas. Cuando lisamos bacterias, colocamos todo el mejunje en una columna IMAC con níquel haciendo que se queden enganchadas. Para quitar nuestra proteína enganchada, colocamos imidazol que es un análogo de la histidina haciendo que se separen. Ahora tendremos nuestra proteína contaminada que la podremos separar mediante un gel filtración. Para eliminar nuestra cola de histidinas, lo haces mediante una proteasa que tiene su diana de restricción justo antes de la cola de histidinas. HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) constituye la forma más eficaz de llevar a cabo un proceso cromatográfico. Su característica principal es su alta resolución con respecto a la cromatografía convencional. Esto no es un tipo de cromatografía, es otro método para hacer cromatografías distinto que nos permite aumentar la resolución de nuestra cromatografía haciendo que los picos que salen sean más estrechos y separados. Lo único que se ha cambiado es la física de la columna.
IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography )
Ejemplo elución especifica: por competencia con un análogo a la moléculaEjemplo elución especifica: por competencia con un análogo a la molécula
purificada
Técnicas Instrumentales Bioquímica Tema 3 14 Tenemos partículas muy pequeñas que no solo dejamos caer sobre la columna para prepararla, sino que se presionan para que queden sobrepresionadas y se tapa la columna para que mantenga presionado. Las presiones que se ejercen sobre esta columna son del orden de 30 a 40 atm. Las fases estacionarias han de estar formadas por partículas de mucha mayor rigidez mecánica que las empleadas en fases estacionarias de cromatografías convencionales, y este lecho cromatográfico tiene que estar más finamente dividido (con mayor capacidad de empaquetamiento). Además, las columnas suelen ser de acero inoxidable y cortas. El flujo de la fase móvil es mucho más lento ya que hay menos huecos. Lo único diferente son las bombas de alta presión y las válvulas de inyección de muestras. Las bombas de alta presión, son bombas de pistón que hacen que se reduzca el volumen del líquido haciendo que se aumente la presión del líquido. Cuando la presión es suficiente se abre la válvula y sale disparado. En cuanto a las válvulas, son dos disco donde uno tiene 4 agujeros y el otro tiene 2.
H igh P ressure (Performance) L iquid C hromatography
OGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (CLAR) ERÍSTICA PRINCIPAL: ALTA RESOLUCIÓN RESPECTO A LA CROMATOGRAFÍA CIONAL CIÓN DE UNA CROMATOGRAFÍA MNA: : CONSEGUIR PICOS OS Y SEPARADOS N DE PICOS: SELECTIVIDAD Fe/Fm ) gradientes GADOS: EFICIENCIA, FACTORES , Ejemplo de bomba de alta presión (^) Ejemplo de detector Ejemplo de válvula de inyección de muestra http://www.lcresources.com/resources/getstart/2c01.htm
mba de alta presión Ejemplo de detector
a de inyección de muestra
http://www.lcresources.com/resources/getstart/2c01.htm
