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Tema 4. Electroforesis
Las moléculas se pueden separar en función de su carga y peso. Respecto a la idea de que moléculas pueden ser analizadas de esta manera, las que están cargadas son el DNA y las proteinas mientras que los glúcidos tienen carga neutra, los lípidos son muy difíciles que sean solubilizados en un medio polar (necesario para que pase la corriente). La electroforesis es principalmente analítica, pero también puede ser preparativa en circunstancias concretas. La persona que diseño la electroforesis con finalidad de análisis de muestra fue un ganador del premio nobel.
La movilidad electroforética indica la velocidad a la que se mueve la partícula en el campo eléctrico. Hay que estandarizarlo por la intensidad del campo eléctrico. Las unidades se definen:
En el caso de la movilidad electroforética, los factores que le influyen son tan grandes que es difícil de determinar una unidad estandarizada. Las variables que afectan son:
- El campo eléctrico. Va variando durante el proceso de la electroforesis ya que varia la resistencia que ofrece el medio, podemos ofrecer más resistencia o menos que hace que el campo eléctrico.
- La molecula Las moléculas conceptualmente se mueven por su densidad de carga : podemos tener una molecula muy grande y muy cargada que se mueva de manera distinta si esta misma esta cargada de manera negativa. A parte de la masa y de la carga, la forma tambien determina la movilidad de la partícula. Las características físicas que determinan la movilidad son la carga , la masa y la forma. Podemos hacer que la electroforesis haga que todas las moléculas tengan la misma densidad de carga y la misma forma, es decir, fijar cualquiera de las tres variables para variar otras.
- El tampón de electroforesis contiene los iones que transportan la corriente desde el punto positivo al negativo o al revés. El tampón tambien puede hacer variar el pH (muy importante en la electroforesis de proteinas). Presencia de agentes desnaturalizantes para cambiar la forma de las moléculas para que estas tengan todas las mismas formas.
- Soporte Este impide el movimiento, dificulta que las moléculas se muevan libremente. La movilidad electroforética variara en función del soporte que se utilice. Es imposible estandarizar. Un soporte no restrictivo sería útil en una electroforesis libre. Si las moléculas se mueven en un soporte, la resistencia que ofrece el soporte al movimiento de las moléculas es la misma, neta (la molecula A tendrá la misma resistencia para atravesar el soporte que la molecula B). Se utiliza para separar las moléculas por carga y masa. En un soporte restrictivo afectan a la movilidad de cada una de las moléculas: contra más grande y rígida es, más resistencia tendrá al movimiento. Son los más frecuentes.
En bioquímica se puede utilizar la estrategia de las moléculas patrón. Se usan para extrapolar respecto a una proteina problema cual es su movilidad en el soporte. Se utilizan cuando en la
electroforesis tenemos muchas variables. A partir de estas moléculas patrón, si se han separado por tamaño, podemos calcular la movilidad electroforética y extrapolar el valor.
Rf La distancia recorrida por una banda respecto la distancia que recorre el frente de iones y que marca el tiempo que está en marcha la electroforesis. Indica la distancia respecto al tiempo. Contra más pequeño sea el RF, mas masa tendrá. Esto nos ofrece una recta patrón (log de la masa respecto al RF).
TIPOS DE ELECTROFORESIS
- Horizontales y sumergidas para la separación de DNA.
- Gel de agarosa Es un tipo de soporte que debe estar sumergido. La agarosa al ser termoestable, debe estar sumergida. El tampón refrigera ya que se aplica una alta temperatura (no tiene resistencia térmica).
- Restrictivo para el DNA y no restrictivo para proteinas (los poros que deja la agarosa son los suficientemente grandes como para que las proteinas puedan atravesarlos libremente).
- Verticales no sumergidas (el tampón de abajo y el de arriba están comunicados por el gel) se utilizan para la separación de proteinas. - La poliacrilamida tiene resistencia térmica y se utiliza para la electroforesis vertical. Es mucho más eficiente.
Gel de agarosa La agarosa esta deshidratada inicialmente. La sometemos a un tampón para hidratarla y además la sometemos a temperatura. Los polímeros de la agarosa quedan individualizados. A medida que la temperatura baja, los polímeros de agarosa se agregan entre ellos dejando a la agarosa con una consistencia de gel (sólida pero porosa por donde se moverán las moléculas).
Es resistente a temperaturas menores a 35º y a pH básicos. Los geles de agarosa se pueden hacer a diferentes concentraciones. La diferencia es que cuanta más agarosa tengamos, las paredes son más gruesa y los agujeros más pequeños. La concentracion de agarosa hace variar el tamaño del poro del soporte y hace variar pues la restricción. A más concentración de agarosa, focalizo la separación en moléculas en tamaños pequeños y viceversa. Fenómeno electroendosmótico Mientras la agarosa sea neutra todo funciona correctamente, pero que si presenta impurezas estas pueden modificar la movilidad electroforética. Deben ser pues extremadamente puras. La ventaja es que no desnaturaliza ni las proteinas ni el DNA.
Para la visualización de las moléculas separadas:
- Tinción con bromuro de etidio u otros colorantes SYBR (aplicación de la técnica de fluorescencia de frio) se intercala entre las bases nitrogenadas. El bromuro de etidio, de manera norma, solo absorbe luz a una determinada longitud de onda pero sin emitirla. Solo emite luz cuando esta intercalado dentro del DNA, las bases nitrogenadas le transmiten energía necesaria.
- Hibridación. Identificación fragmento de DNA por la complementación con otro fragmento.
- Marcación previa del DNA reactivamente o mediante fluorocromos.
La densidad de carga es masa/carga. Esto, en el DNA es constante y por tanto la forma de separarse no es mediante la densidad carga ni por la forma sino que es por tamaño. Tenemos un
Una aplicación seria para distinguir las diferentes cepas de E.coli.
Geles de poliacrilamida Se hacen en un soporte porque es termoestable (la poliacrilamida resistente a 80º).
Se mantiene en forma monomérica. Si a las moléculas de acrilamida y bisacrilamida le añadimos un donador de electrones (persulfato) y un catalizador (temed) los monómeros de acrilamida se juntan formando polímeros largos. Estos polímeros largos se entrecruzan con los monómeros de bisacrilamida. Esto adquiere un aspecto reticular que formará poros. El tamaño de los poros dependerá de la cantidad de poliacrilamida.
Contra más acrilamida, más densidad de estos polímeros y de menor tamaño serán los poros. A más % de poliacrilamida, más cantidad de moléculas pequeñas podremos separar y viceversa. Restrictivos para proteinas y ácidos nucleicos (moléculas de pequeño tamaño o monohebra).
La corriente va desde el interior hasta el líquido de fuera. La aplicación de la muestra se hace en la parte superior El tampón de carga o marcador electroforético es denso (glicerol) y de color azul (azul de bromophenol). Este compuesto es una molecula muy pequeña y muy cargada que marca la banda de la electroforesis. Tiene una movilidad electroforética mas alta y marca el frente de la electroforesis ya que se mueve más rápidamente que el resto de las partículas.
EJEMPLOS DE ELECTROFORESIS
• DNA
Geles de retardo Esta técnica se utiliza para el reconocimiento de proteina en secuencias de DNA: enzimas de restricción o los factores de transcripción, de manera inespecífica una histona que forma un nucleosoma. Queremos reconocer esta interaccion mediante el gel. A consecuencia de que hablamos de un reconocimiento biológico, estos geles deben ser nativos, sin ningún agente desnaturalizante.
En un eppendorf colocamos la secuencia de DNA que queremos testar (30-40 pb) donde esta secuencia de la proteína. Además ponemos un extracto nuclear donde podría estar el factor. Esta mezcla de fragmentos de DNA libres, complejos DNA – proteina y proteinas libres. La electroforesis las separa todas. Si el gen es nativo, las proteinas no histonas están muy poco cargadas (poca densidad de carga) y casi no se mueven a pH fisiológico. El DNA si lo tiene ya que presenta muchas cargas negativas y se mueve más. Asi, las proteinas no se mueven mucho y quedan en la parte de arriba, los fragmentos de DNA llegan hasta abajo porque están muy cargados y en el medio quedan los complejos DNA proteina. Esto es asi porque en un fragmento de DNA (20 cargas) se unen proteinas, muchas de esas cargas han quedado apantalladas por esta. La proteina anula parte de las cargas del DNA. La densidad de carga (masa/carga) ahora ha disminuido (la masa aumenta y la carga disminuye), haciendo que la movilidad electroforética también disminuya. Hay un retardo en la movilidad electroforética del DNA. Se conocen tambien Es un experimento típico donde se crean dos carriles: uno donde tenemos proteina para controlar la movilidad del DNA solo y otro donde hay proteina. Es un técnica típica para la interaccion DNA - proteina.
Método de secuenciación clásico de Maxam – Gilbert. Electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante para DNA. Utiliza una polimerasa. Queremos secuenciar un fragmento monohebra del DNA cuyos extremos 5’ están marcados. La muestra se reparte en 4 tubos iguales en donde se les añade un didióxido. Es un nucleótido normal en el que el –OH del carbono de la ribosa (enlace fosfodiester) se transforma en hidrogeno. Eliminamos un oxigeno. Esto provoca que se impida la formación de enlaces fosfodiester una vez que el didióxido se incorpora. Siempre que se incorpora esta componente, paramos la cadena. De esta manera obtenemos moléculas paradas con una base nitrogenada, con una longitud diferente. Hacemos una electroforesis para separar. Nos interesa el tamaño de la molecula pequeña. Debe ser una electroforesis que nos permita ver el DNA desnaturalizado y por eso hacemos uso de geles desnaturalizantes cuyo componente principal es la urea. Queremos ver las cadenas que están creciendo.
De abajo a arriba: TTACTGGG
Secuenciación automática Analizamos un mismo fragmento de DNA pero en este caso el primer no es lo que se marca sino que son los ribeoxiódos. Tras someterlos a reacción se obtendrán fragmentos de diferentes tamaños y colores en función de la base que sea. Cargamos solamente un solo carril. A medida que las bandas de DNA van pasando a través del fluorímetro, vemos el color de la banda correspondiente. Esto se interpreta en forma de picos. No es un método de secuenciación masiva aunque se utiliza de manera normal. Se utiliza un gel de poliacrilamida desnaturalizante.
• PROTEÍNA
Para poder detectar las proteinas:
- Tinción:
- Coomasie Blue
- Nitrato de plata
- Colorantes fluorescentes
- Actividad ■ Si lo que queremos teñir es una enzima, podemos añadir el producto para esta. Cuando se dé la reacción se generará un nuevo producto con color que precipitará. ■ Geles nativos
- Marcaje radiactivo de las proteinas.
Se caracterizan por tener un sistema discontinuo. En realidad, en una electroforesis SDS-PAGE hacemos dos geles uno encima de otro. Hay una primera parte que cuando se solidifica la parte abajo que, una vez solubilizada solubilizamos la parte arriba que por donde introduciremos la muestra. El gel de SDS tiene dos bases, dos geles. La electroforesis no es uniforme en todo su recorrido ya que hay condiciones diferentes que afectan a la movilidad de las moléculas. Estas dos fases facilitan el aumento de la resolución. Aumentamos la resolución mediante el uso de dos geles en la misma electroforesis. Queremos con ello ver muchas proteinas discretas. Resolutivo implica que tengamos dos bandas totalmente separadas y no fusionadas que nos permita verlas claramente. Hacemos una primera electroforesis o gel concentrador de manera que todas las proteinas queden concentradas en una misma raya. Cuando se comienzan a separan se separan individualmente. Existe un segundo gel, gel separador , separa las proteinas que han quedado concentradas en la misma línea. Para ello debemos eliminar el factor que hace que las proteinas se separen entre ellas: el tamaño y que el soporte fuera restrictivo. Debemos reducir el % de acrilamida en el gel concentrador. Esto favorece que las proteínas no se separen entre ellas y corran a la misma velocidad todas juntas. De alguna manera, las proteinas deben correr más deprisa o que avancen al frente de iones. Normalmente, la corriente eléctrica la lleva el frente de iones y corre de manera más rápida. Nuestro objetivo es conseguir que las proteinas vayan a la misma velocidad que el frente de iones. Para ello jugamos con el pH. Los geles de SDS trabajan con un tampón que es Tris – HCl. La muestra está disuelta en un tampón con pH 8,3 al cual la glicina se encuentra disociada. Sin embargo, la glicina en el tampón con el que hemos hecho el gel concentrador (pH 6,7) pasa a tener su punto isoeléctrico y tiene una carga neta. Deja de tener carga. Las únicas cosas que están cargadas en el gel son las proteinas y pasan a ser los “iones” que transportan la corriente y corren más deprisa y todas juntas hasta que chocan con el gel separador. En este momento quedan todas concentradas ya que tienen mucha dificultad para moverse y, al cambiar el pH, la glicina es la que ahora transportará la corriente.
Es muy importante:
- Cambio de pH
- Porcentaje de acrilamida
Electroenfoque Que las proteinas estén cargadas o no depende del pH del medio. Las proteinas fisiológicas tienen una carga. La carga de las proteinas es por tanto muy variable en un gel normal nativo. Las proteinas podrían moverse en un sentido contrario al de las otras. ¿ Podemos separar las proteinas por la carga intrínseca de las proteinas? Teóricamente sí. Para ello debemos de jugar con el pH. Cuando el pH del medio coincide con el punto isoeléctrico de la proteina, la proteina no se moverá ya que la carga de la proteina es 0. La idea es hacer una electroforesis con un gradiente de pH en un gel nativo para poder ver la carga intrínseca de las proteinas y no restrictivo ya que no queremos que se separen por su tamaño sino por el punto isoeléctrico. Quedarían focalizadas en su punto isoeléctrico.
Este gradiente de pH se crea mediante el uso de unas moléculas muy pequeñas anfolitos con puntos isoeléctricos muy cercanos entre ellos y que si se mezclan y gelifican la poliacrilamida en presencia de estos, estos se orden por carga generando un gradiente de pH. Las casas comerciales venden unas tiras, inmovilinas , que consisten estos mismos anfolitos unidos a la poliacrilamida teniendo ya un gradiente estable de pH. En función del intervalo de pH utilizado podremos separar mejor unas proteinas de otras. Es una especie de soporte horizontal donde la tira se pone atravesada. Tambien esta presenten un tampón superior y otro inferior. Solo se carga una muestra por tira. En este caso no es necesario tener un gel apilador porque la resolución viene dada por el enfoque. Todas las proteinas se concentran en su punto isoeléctrico. Ellas solas se focalizan.
Estos electroenfoques son útiles para hacer geles bidimensionales. Es decir, hacer una electroforesis separando mediante un criterio en una dirección y mediante otro criterio separar en la dirección contraria. Identifican muestras o comparar proteinas presentes en una muestra concreta. Comparar patrones concretos en distintos tipos de tejidos.
Cada una de las bandas corresponde a proteinas en punto isoeléctrico determinado. Podemos tener más de una proteina con el mismo Pi. Desmontamos esta electroforesis creada por Electroenfoque y se sumerge en SDS para que las proteinas queden negativamente cargadas. Hacemos una segunda dimensión en un gel SDS. Con esto se consigue que a partir de cada una de estas bandas salgan una serie de manchas con diferentes pesos moleculares. Cada una de las manchas es un proteina con un peso molecular y un Pi determinado. Estos tipos de geles bidimensionales se usan en proteómica (identificar muestras o comparar proteinas en dos tejidos diferentes).
