¡Descarga Cuaderno de prácticas microbiología y más Ejercicios en PDF de Microbiología solo en Docsity!
Raúl Muñoz Bermejo G CUADERN DE PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA 2019/
- Día 1: El primer día procedimos a realizar el aislamiento de microorganismos de suelo, para ello recogimos tierra del suelo, pesemos un gramo y realicemos diluciones desde 10 -1^ hasta 10-4, preparando dos diluciones de 10-3^ (una de ellas la introducimos en un baño a 80ºC durante 15 min para destruir las células vegetativas, pero dejar las endosporas para recuperar esos organismos). Las diluciones las sembremos con alícuotas de 1000μL por extensión con asa de Digralsky, la siembra la realicemos con las diluciones 10-3^ y 10-4^ en medios RB (con antibiótico para inhibir el crecimiento de procariotas, así crecen hongos y levaduras), AC (para el aislamiento de actinobacterias), AZ (donde no hay N, así crecen fijadores de N) y AM (para el aislamiento de amiolíticos). Posteriormente sembremos en medio AN (aislamiento de bacterias y bacilos esporulados) la dilución a la -3 calentada y otra sin calentar. Todo esto lo incubamos a 30ºC (porque se parece a la temperatura ambiente de la tierra). A continuación, comencemos con el análisis microbiológico del agua para comprobar la calidad higiénico- sanitaria del agua recogida y determinar la presencia de coliformes fecales en ella, para ello coloquemos 3 series de tubos, la primera con 5 tubos con 10mL de caldo MacConkey 2x a los que añadimos 10mL del agua recogida, la segunda con 5 tubos con 5mL de caldo MacConkey 1x más 1mL del agua y la tercera con otros 5 tubos con 5mL de caldo MacConkey 1x con 0,1mL del agua, todos ellos con campanas de Durham dentro. Todos ellos los incubemos a 37ºC (porque es la temperatura media corporal y así vemos si crecen organismos patógenos) 24horas. - Día 2: En el segundo día, primero realicemos la prueba presuntiva del análisis microbiológico del agua, en ella nos salió que el número más probable de coliformes era de 79 por 100mL de agua. A continuación, realicemos la prueba confirmativa, en la que tomemos 20μL de un tubo positivo y lo sembremos por agotamiento en dos placas de medio Agar Levine (es un medio selectivo, porque inhibe el crecimiento de gram + y diferencial, porque los distintos organismos que crecen pueden tener aspecto diferente), estas se incubaron durante 24 horas una a 37ºC (crecerá Escherichia y Enterobacter ) y otra a 44ºC (crecerá solo Escherichia ). Por otra parte, sembremos por estría una placa Levine desde un cultivo puro de E. coli (derecha) y Enterobacter aerogenes (izquierda), cada bacteria en una mitad de la placa, lo incubamos 24 horas a 37ºC. A continuación, determinemos la densidad microbiana de una suspensión de Saccharomyces cerevisinas , para ello suspendimos levadura fresca en agua estéril (50mL volumen final), después realicemos diluciones 10-1^ - 10-7^ (2 tubos de 10-4), luego medimos la DO600nm de las diluciones 10 -1^ y 10-4. Los resultados que obtuvimos fueron: Concentración celular bacteriana (μg/mL) Absorbancia 10 -1^ 1,902nm 10 -2^ 0,930nm 10 -3^ 0,124nm 10 -4^ 0,012nm
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4. 0
1
2
Densidaad celular observada a 600nm
Concentración celular bacteriana (μg/mL) Absorbancia En el eje de la x el uno se corresponde a la dilución 10-4, el 2 a 10-3, el 3 a 10-2^ y el 4 a 10-1. Después realicemos el recuento directo de microorganismos totales con la cámara de Thoma, para ello cogimos 10μL de la dilución 10-2^ de la levadura. Nosotros contabilicemos 168 células en el cuadrado mediano, esto lo multiplicamos por 16 cuadrados medianos que hay y da un total de 2.688 células, por lo que la concentración de nuestra muestra es de 2.688x10^4 cel/mL. Para acabar el segundo día preparemos un recuento de microorganismos viables (aquellos capaces de formar colonias), para ello sembremos en 4 placas de medio TSA 100μL con el asa Digralsky de las diluciones 10-4^ – 10-7.
- Día 3: Al comienzo del tercer día vimos los resultados de la prueba confirmativa del análisis microbiológico del agua Placas sembradas por agotamiento con un tubo positivo una a 37ºC y otra a 44ºC, en ellas observamos bacterias fermentadoras de lactosa con el color violeta ( Enterobacter ) o azul oscuro ( E. coli ) y ningún coliforme fecal, el cual tiene un color verde metálico y se vería mejor en la placa a 44ºC.
A continuación, realicemos un antibiograma, para evaluar el efecto inhibidor de los antibióticos E (Eritromicina), A (Amoxicilina) y K (kanamicina), en E. coli (Gram -). Para ello añadimos 1,8mL de cultivo de E. coli a una botella de 50mL de TSA (48ºC) y lo vertemos en una placa Petri de 140mm, cuando se solidifique colocar los discos antimicrobianos de la siguiente forma. Dejamos difundir los antimicrobianos en el agar a 4ºC 2 horas y después incubar 30ºC 24 horas. Cuando acabemos con la titulación de una suspensión de fagos landa, para ello realicemos diluciones de la suspensión de fagos en solución SM de la dilución 10-2^ (partíamos de ella) hasta la 10-5^ con un volumen final de 1.000μL, a continuación, mezclamos 100μL de células E. coli (comida para el fago) con 100μL de las diluciones de los fagos en tubos de 10mL durante 5 min, después añadimos NZY de cobertera (unos 5mL) en cada tubo, lo mezclamos y vertemos sobre placas NZY cubriendo toda superficie (en unos 5 segundos) sin que se formen burbujas ni grumos, cuando se solidifique invertimos la placa e incubamos a 37ºC.
- Día 4: Para comenzar observemos los resultados de las pruebas del día anterior, empezando por el bioensayo, en el cual medimos los diámetros de los halos de inhibición que se habían formado y los resultados fueron:
Concentraciónlogaritmo: 6 0,77 3 0,477 1,50,17 0,75-0,124 0,375-0, -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 5 10 15 20 25 30 35 33 28 21 16 14 f(x) = 16.72 x + 19.
Bioensayo
Log (antib) (microgramo/mL) Diámetro (mm) La muestra problema “pen G” M tenía un diámetro de 24mm, según la ecuación de la recta tenía una concentración de 1,69μg/mL de antibiótico. Después vimos los resultados del Antibiograma, en el cual pudimos observar que la Amoxicilina tiene más sensibilidad a E. coli , seguido de la kanamicina y la que menos la Eritromicina.
de agar de Simmons, también realicemos la prueba de la ureasa, en la cual las bacterias con actividad ureasa descomponen la urea y alcalinizan el medio que toma color rosa debido al cambio de color rojo fenol, la prueba de la catalasa, para ver si la bacteria posee esta enzima y el ensayo de Kligler, en la cual inoculamos la bacteria problema en tubo con slant en un medio diferencial, realizando siembre en superficie y con picadura, para ver el crecimiento con baja concentración de oxígeno. Para terminar la práctica realicemos la práctica API20E, que es un sistema específico para enterobacterias (gram-), el cual consta de 20 microtubos con sustratos deshidratados para 20 pruebas bioquímicas, el resultado genera un número de 7-9 dígitos los cuales se corresponden con una enterobacteria, para realizar esta prueba tuvimos que resuspender 5mL de NaCl 0,9% en una colonia de 2-3mm, rellenar los alveolos de la cámara (donde se colocaran las tiras API) con agua, rellenar con la suspensión microbiana los pocillos de izquierda a derecha de cada uno según lo indicado, disponer la tira en la base, cerrar con la tapa e incubar a 37ºC 24horas.
- Día 5: En este último día vimos los resultados de las pruebas bioquímicas y el análisis del suelo. Los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas mediante la prueba IMViC fueron: Prueba del citrato Prueba de indol Positivo Negativo Prueba Rojo de Metilo Prueba de Voges-Proskauer Positivo Positivo Prueba de la ureasa Prueba de la catalasa
Negativo Positivo Ensayo de Kligler: crece la bacteria en la siembra en picadura, con lo cual no necesita oxígeno Después revelamos las pruebas API
- Medio AZ (detección de fijadores de vida libre como Azotobacter ): búsqueda de colonias de aspecto mucoso y realizar tinción negra para ver las cápsulas.
- Medio AC (aislamiento de actinobacterias): detección de colonias planas color marfil, aspecto aterciopelado
- Medio AN (aislamiento de bacilos esporulados): detección de colonias de bacilos esporulados y comprobación mediante tinción simple con azul de metilo
