Cuaderno de prácticas: Práctica 3, Ejercicios de Bioquímica

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Práctica 3: Espectrofotometría. Determinación cuantitativa de proteínas. Isabel María Serrano Molina

1. Fundamento teórico

La espectrometría: Conjunto de técnicas muy utilizadas que se basan en la propiedad que tienen las sustancias. Cuando una reacción electromagnética llega a una sustancia, esta absorbe una longitud de onda concreta. Las reacciones electromagnéticas son ondas cuyo espectro va desde las ondas de radio, microondas, infrarrojos, visible, ultravioleta, rayos X y rayos gamma. En espectrofotometría trabajamos con longitudes de onda: Infrarrojo-ultravioleta La espectrofotometría puede utilizarse con fines:  Cualitativos : Cuando queremos saber que tengo en una muestra problema. En este caso, la muestra se somete a longitudes de onda sucesivas hasta detectar un pico de absorbencia.  Cuantitativos : En estos fines lo que yo quiero es saber la concentración de una sustancia determinada de nuestra muestra. Trabajamos a una longitud de onde concreta. Será aquella que nuestra sustancia absorba. El poder cuantificar por espectrofotometría es gracias a la ley de Lamber Beer. La absorbancia (densidad óptica o extinción) es igual a: A= Ebc Donde E y b son constantes y c es la concentración. De forma que la absorbancia que posee una longitud de onda es proporcional a su concentración. La mayoría de sustancias que se cuantifican en bioquímica clínica se hacen por espectrofotometría y en concreto colorimetría. Técnicas colorimétricas: Son aquellas técnicas fotométricas que trabajan con longitudes de onda con el espectro visible. La característica principal es que cuantifica sustancias que están coloreadas. La mayoría de las biomoléculas con valor diagnostico tienen que pasar por un previo paso de tinción.

2. Metodología

Vamos a trabajar con una técnica fotométrica para cuantificar proteínas. Existen distintas formas para colorear las proteínas, pero nosotros seguiremos el método de BIURET. Comprobó que las proteínas con sales de cobre y pH alcalino adquieren un color azulado púrpura. Presenta su máxima absorbancia a 545 nm. Trabajaremos con unas gradillas, unos tubos numerados y unos patrones.  Con una pipeta automática y una punta blanca ponemos 5 ml de Diuret. Ponemos 5 ml de Diuret en todos los tubos de ensayo numerados (0, 50, 65, 75, 90, X).  También tenemos unos tubos verdes rotulados. Son patrones de proteínas (Disoluciones de proteínas de concentración conocida). En el tubo 0  0 Concentración En el tubo 50  50 concentración En el tubo 65... En el tubo 75… En el tubo 90… Una muestra X que es nuestra muestra problema.