UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR
GRAU EN QUÍMIQUES
PRÀCTIQUES DE BIOQUÍMICA I
QUÍMICA BIOLÓGICA
Curs 2017-2018
V
máx
K
m
(1+[I]/K
I
)
K
m
sin I
con I
v
0
[S]
E + S ES E + P
I
+
EI
K
I
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Orientación Universidad
Prepara tus exámenes
Prepara tus exámenes y mejora tus resultados gracias a la gran cantidad de recursos disponibles en Docsity
Busca documentos
Prepara tus exámenes con los documentos que comparten otros estudiantes como tú en Docsity
Busca tu universidad
Encuentra los documentos específicos para los exámenes de tu universidad
Video Cursos
Estudia con lecciones y exámenes resueltos basados en los programas académicos de las mejores universidades
Quiz
Responde a preguntas de exámenes reales y pon a prueba tu preparación
Consigue puntos base para descargar
Gana puntos ayudando a otros estudiantes o consíguelos activando un Plan Premium
Comunidad
Pregúntale a la comunidad
Pide ayuda a la comunidad y resuelve tus dudas de estudio
Ebooks gratuitos
¡Nuestros e-books salva-estudiantes!
Descarga nuestras guías gratuitas sobre técnicas de estudio, métodos para controlar la ansiedad y consejos para la tesis preparadas por los tutores de Docsity
Asignatura: Bioquímica, Profesor: , Carrera: Química, Universidad: UV
Tipo: Ejercicios
2017/2018
1 / 19
Esta página no es visible en la vista previa
¡No te pierdas las partes importantes!
Documentos relacionados
Vista previa parcial del texto
¡Descarga cuaderno practicas y más Ejercicios en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR
GRAU EN QUÍMIQUES
PRÀCTIQUES DE BIOQUÍMICA I
QUÍMICA BIOLÓGICA
Curs 2017 - 2018
V
máx
K
m
( 1 +[I]/K
I
)
K
m
sin I
con I
v
0
[S]
E + S ES E + P
I
+
EI
K I
ÍNDEX
Consideracions generals
Seguretat i treball en el laboratori 2
Elaboració i presentació de resultats 2
Guió de pràctiques
Pràctica 1: Representació i anàlisi d’estructures de macromolècules 4
Pràctica 2: Activitat enzimàtica fosfatasa alcalina 5
Pràctica 3 : Obtenció i anàlisi electroforètica de DNA 9
Pràctica 4: Metabolisme d’hidrats de carboni 15
CONSIDERACIONS GENERALS
Seguretat i treball en el laboratori
Els laboratoris són considerats llocs de treball perillosos i els usuaris han de
ser conscients dels riscos potencials i de la manera en què s’ha d’actuar en cas
d’urgència. Cal portar bata, preferiblement de cotó, per tal de protegir-se dels
productes químics. Com a protecció personal, s’utilitzaran les ulleres de seguretat
i els guants i les màscares, si és el cas.
En el laboratori no s’ha de menjar, ni tampoc beure, per tal d’evitar el perill
d’enverinament per contacte accidental d’algun compost amb la boca.
Cal netejar el material abans i després d’usar-lo.
S’ha de manipular amb precaució el material de vidre, per tal d’evitar
trencaments.
Mai s’han de pipetejar les solucions amb la boca sinó amb l’ajuda d’una
propipeta. No pipetegeu mai directament del flascó d’aigua destil·lada.
Cal fixar-se en el nom de les solucions i els productes abans d’utilitzar-los.
S’han de manipular amb precaució els solvents i productes tòxics. Abans de tirar
qualsevol solució a la pica, obriu l’aixeta i deixeu córrer una estona l’aigua. Els
productes perillosos no han de vessar-se en les piques. En el laboratori hi ha
recipients adequats per a la recollida dels residus perillosos (bromur d’etidi,
fenol...). També hi ha recipients per recollir els fragments de vidre en cas de
trencament.
Elaboració i presentació de resultats
L’objectiu del treball de laboratori és la comunicació de resultats i d’idees
als altres d’una manera comprensible. La redacció d’un treball pràctic (els
PRÀCTICA 1
REPRESENTACIÓ I ANÀLISI D’ESTRUCTURA DE
MACROMOLÈCULES
La informació relativa a aquesta pràctica es troba al següent link:
www.uv.es/bbm/bqq
PRÀCTICA 2
ESTUDI DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA FOSFATASA-ALCALINA
Els enzims són catalitzadors específics i potents que fan possible la
coexistència d’un elevat nombre de reaccions químiques dins la cèl·lula. En la
majoria dels casos, són de naturalesa proteica, però també se’n coneixen que són
RNA. El mecanisme de cinètica enzimàtica més simple és el representat per
l’equació de Michaelis-Menten, que explica el fenomen de saturació.
Les fosfatases-alcalines (PA) són enzims (ortofosfòric-monoèster-
hidrolases), àmpliament distribuïts en organismes procariotes i eucariotes,
responsables d’eliminar grups fosfat d’una varietat de molècules com nucleòtids,
proteïnes i alcaloides. En teixits animals, es localitzen en la membrana i són
particularment abundants en ossos, fetge, placenta, intestins i ronyó; l’augment o
disminució de PA en plasma sanguini té significat clínic. La PA d’ Escherichia
coli és un metal·loenzim dimèric (Mr del monòmer 94 000 ) amb 2 àtoms de Zn i
1 de Mg per monòmer. S’ha determinat l’estructura tridimensional de l’enzim i se
sap que el residu de Ser que es fosforila reversiblement i transitòriament durant la
catàlisi es localitza prop dels llocs d’unió dels metalls, en una butxaca on cap el
fosfat inorgànic, el qual pot actuar com a inhibidor de la reacció. L’enzim actiu es
localitza en l’espai periplàsmic i catalitza la hidròlisi inespecífica d’èsters de
l’àcid fosfòric, substàncies que normalment són incapaces de travessar la
membrana plasmàtica. La síntesi de l’enzim augmenta quan les cèl·lules creixen
en medis deficients en fosfat, la qual cosa explica la funció de l’enzim per
subministrar fosfat inorgànic al bacteri.
L’acció de la fosfatasa-alcalina sobre un substrat artificial incolor com és el
fosfat de p - nitrofenil origina fosfat inorgànic (P i
) i un producte de color groc que
absorbeix llum visible de 400 nm i amb un coeficient d’extinció molar (ε) de
4
M
- 1
cm
- 1 . Ací farem ús de la colorimetria, una tècnica espectroscòpica, per
tal de realitzar les anàlisis cinètiques d’un enzim.
L’objectiu és l’obtenció dels valors de velocitats inicials de reacció catalitzada
per la fosfatasa-alcalina d’ E. coli en absència i en presència de fosfat inorgànic,
un inhibidor de l’enzim. A partir de la representació gràfica dels dobles inversos
(Lineweaver-Burk) es determinaran els paràmetres cinètics (constant de
Michaelis , K m
, i V). També es calcularà el valor de la constant de dissociació de
l’inhibidor (K i
Una vegada acabat l’experiment, calculeu les velocitats inicials de reacció
(v 0
= Δ[P]/s) de cadascuna de les mescles i representeu, en paper mil·limetrat, els
valors inversos de v 0
(en l’eix d’ordenades) enfront dels inversos de la
concentració de substrat (en abscisses) i calculeu els valors dels paràmetres
cinètics K m
i V.
2.2. Cinètica de la fosfatasa-alcalina en presència d’inhibidor
Es prepararan les mescles de reacció que s’indiquen en la Taula 2 i es
procedirà s’ha indicat anteriorment.
Taula 2 (Volums en mL)
Cubeta 1 2 3 4 5
Tampó Tris 2 M pH 8 0,65 0,65 0,65 0,65 0, 65
Aigua 0,58 0,54 0,50 0,35 0,
Inhibidor (fosfat sòdic 3 mM) 0,05 0,05 0,05 0,05 0,
Substrat 1 mM 0,07 0,11 0,15 0,30 0,
A cadascuna de les mescles de reacció se li afegeixen 0,15 mL de la solució
d’enzim.
Una vegada acabat l’experiment, calculeu les velocitats inicials de reacció
(v 0
= Δ[P]/s) de cadascuna de les mescles i representeu els valors sobre la mateixa
gràfica que deriva de les anàlisis cinètiques en absència d’inhibidor. Calculeu els
paràmetres cinètics de la reacció inhibida i la constant de dissociació de
l’inhibidor.
QÜESTIONS PRÀCTICA 2
1. Expliqueu per a què es fan servir els següents reactius, instruments i/o
paràmetres:
(a) Colorímetre;
(b) Tampó;
(c) Fosfat de p - nitrofenil;
(d) Coeficient d’extinció molar.
2. Contesteu vertader o fals i raoneu breument la resposta: “El pendent de la
gràfica en la qual es representa la velocitat inicial de reacció (v 0
, M/s) en funció de
la quantitat de substrat (M) ens permet determinar la constant de Michaelis”.
3. Considereu la reacció enzimàtica A→B, on A és un substrat de color groc amb
un màxim d’absorció a 420 nm i B és un producte de color verd amb un màxim
d’absorció a 560 nm.
(a) Proposeu dos mètodes per determinar la velocitat de reacció enzimàtica a
una concentració fixa d’enzim i a concentració saturant de substrat.
(b) Com faríeu per expressar la velocitat en mol de B formats·L
- 1
·min
- 1
4. Per a determinar la velocitat inicial d’una reacció enzimàtica S → P s’ha
mesurat la variació de l’absorbància a 530 nm (màxim d’absorbància de S) en
funció del temps, i s’han obtingut els resultats que es mostren en la taula següent.
Amb les dades de la taula, i sabent que el ε
1 M
del substrat de la reacció és 10. 000
M
- 1
cm
- 1
, feu-ne la representació gràfica corresponent i calculeu la velocitat inicial
de la reacció.
t (min) A 530
Protocol experimental
1. Materials i reactius
—Vòrtex —Microones
—Tim de vedella —Tubs d’Eppendorf
—Homogeneïtzador Osterizer —Varetes de vidre
—Agitador magnètic —Agitador de tubs
—Tubs de vidre de centrifugadora — Thermoblock
—Pipetes de vidre (1, 2, 5 i 10 mL)
—Pipeta automàtica de 200 i 20 μL
—Erlenmeyer de 100 (8) i 250 ml
—Centrifugadora de taula i microcentrifugadora
—Cubeta i accessoris d’electroforesi de DNA
—Font d’alimentació de corrent
—NaCl 10 % (p/v)
—Etanol 96 % fred (-20 °C)
—SDS 10 % (p/v) en etanol 50 % (v/v)
—Cloroform: alcohol isoamílic (3:1)
—Agarosa (Tipus I, A- 6013 , Sigma)
—Cultiu d’ E. coli en LB+Ampicil·lina. Cèl·lules conservades a - 20 °C
—Tampó lisi: 10 mM Tris·HCl pH 8,0; 1 mM EDTA, 15 % (p/v) sacarosa, 2
mg/mL lisozima, 0,2 mg/mL RNasa i 0,1 mg/mL BSA. Conservat a - 20 °C.
—Tampó d’homogeneïtzació: Tris-HCl 0, 01 M pH 7, 5
—Tampó d’electroforesi de DNA: 0,5X TBE (TBE: 45 mM Tris-borat, 1 mM
EDTA. Per a 1 L de 5X TBE pH 8,3: 54 g Tris + 27,5 g àcid bòric + 20 mL
0, 5 M EDTA)
—Mostres d’electroforesi:
Solucions de DNA plasmídic natiu i lineal (fragmentat amb endonucleases de
restricció), de DNA del fag λ i d’unes mescles de DNA de grandàries
diferents (DNA patró: GeneRuler 1kb plus DNA ladder - 4 000, 3 000; 2 500;
2 000; 1 500; 1 000; 750; 500; i 250 pb- SM1334, Fermentas i fag λHindIII -
23 130; 9 416; 6 557; 4 361; 2 322; 2 027; i 564 pb-) preparades en solvent
de mostres d’electroforesi.
—Solvent de mostres de DNA (6X): 0,25 % (p/v) blau de bromofenol, 0,25 %
(p/v) xilencianol i 30 % (v/v) glicerol en tampó Tris-HCl 60 mM, EDTA 6
mM, pH 7,5; i solvent 2X.
2. Procediment
2.1. Obtenció del DNA
2.1.a. Obtenció del DNA cromosòmic de tim de vedella
En un primer pas es procedeix al trencament de les estructures cel·lulars,
seguidament es dissocien els complexos nucleoproteics utilitzant una solució
concentrada de NaCl, un detergent i solvents orgànics i, a l’últim, es purifica el
DNA per precipitació.
S’homogeneïtzen ( atenció a les condicions: 5-10 min en posició Blend de
l’aparell; o bé, al núm. 1 durant uns 5 min) 12 g de tim de vedella trossejat en 150
mL de tampó Tris 0, 01 M pH 7,5. Es transvasa en un erlenmeyer de 250 mL i
s’agita durant 5 min. S’hi afegeix 17 mL de SDS al 10 % en etanol per tal
d’obtenir una concentració final 1 %. S’agita suaument durant 5-10 min. A
cadascun dels grups se’ls dóna 10 mL de la mescla per continuar l’extracció. A
cada alíquota de 10 mL s’afegeix, en un erlenmeyer de 100 mL, 1 volum (10 mL)
de cloroform:alcohol isoamílic (3:1, v:v). Ben tapat l’erlenmeyer, s’agita amb la
mà enèrgicament durant 10-15 min fins a obtenir una mescla homogènia. Es
centrifuga en un tub a unes 4 000 rpm durant 10 min. La fase aquosa superior
opalescent es transvasa en un erlenmeyer de 100 mL. S’hi afegeixen 20 mL de
NaCl 10 % i es mescla. S’hi afegeix 1 volum (uns 25 mL) d’etanol fred i
s’enrotllen les fibres del DNA sobre una vareta de vidre.
2.1.b. Obtenció del DNA plasmídic d’ Escherichia coli
S’utilitza un mètode ràpid d’extracció que consisteix, en un primer pas, en
el trencament de les estructures cel·lulars i la degradació del RNA i després en la
desnaturalització de les diferents macromolècules. Tot açò permet separar el
DNA plasmídic per centrifugació. Amb aquest procediment s’obté, en molt poc de
temps, DNA plasmídic parcialment purificat, el qual pot ser analitzat mitjançant
electroforesi en gel d’agarosa i fins i tot digerit amb endonucleases de restricció.
En un tub d’Eppendorf s’ha preparat un cultiu de la soca d’ E. coli que conté
el plasmidi Bluescript (pBS) de 3, 0 kpb, inoculant una colònia en 1,5 mL de medi
LB+Ampicil·lina i incubant-lo a 37 °C durant 16 h. El cultiu obtingut se
centrifuga a 5 000 rpm durant 5 min, a temperatura ambient, en una
microcentrifugadora. Se n’elimina el sobrenadant per decantació i el sediment
cel·lular es resuspèn en 50 μL de tampó de lisi. S’agita breument en un vòrtex i
s’incuba a 95 °C durant 1 min. Després d’una incubació en gel durant 1 min, se
centrifuga 20 min a la màxima velocitat en una microcentrifugadora i a
temperatura ambient. El sobrenadant, sense arrastrar el sediment, es transvasa a un
altre tub d’Eppendorf.
Preparació d’un gel d’agarosa
QÜESTIONS PRÀCTICA 3
1. Expliqueu com prepararíeu 100 mL de les solucions següents:
(a) Cloroform:alcohol isoamílic 3:1 (v:v);
(b) SDS al 10 % (p/v) en etanol al 50 % (v/v).
2. Expliqueu per a què es fan servir els següents reactius, instruments i/o
tècniques:
(a) Gel d’agarosa (d) Etanol
(b) Bromur d’etidi (e) Font d’electroforesi
(c) Bombeta de llum UV (g) Homogeneïtzador Osterizer
3. Contesteu vertader o fals i raoneu breument la resposta:
(a) El bromur d’etidi s’empra per acolorir proteïnes en electroforesi perquè
s’intercala entre els aminoàcids.
(b) El plasmidi superenrotllat, per ser més compacte i ocupar menys volum que
el plasmidi relaxat, es desplaça més en electroforesi d’agarosa.
(c) La forma lineal d’un plasmidi migra en electroforesi en agarosa amb més
mobilitat electroforètica que la superenrotllada.
4. Heu aïllat DNA de cèl·lules bacterianes. Expliqueu breument com
determinaríeu la concentració de DNA en la solució.
5. En la figura es mostra un gel d’electroforesi en agarosa on s’han aplicat
diferents mostres (en un ordre diferent del que s’indica a continuació):
- Un plasmidi natiu (mostra A);
- El plasmidi digerit amb un enzim de restricció que talla
en un sol lloc (mostra B);
- El plasmidi digerit amb un altre enzim de restricció que
talla en dos llocs (mostra C);
- Patró de grandàries moleculars (mostra D).
(a) Indiqueu en la figura les carreres corresponents a les
mostres A, B, C i D. Justifiqueu l’elecció.
(b) Justifiqueu la mobilitat dels fragments de DNA del
patró de grandàries moleculars.
(c) Quina és la grandària del plasmidi? Justifiqueu la
resposta.
(d) Indiqueu per a les carreres 2, 3 i 4 les característiques
de les molècules de DNA que originen cadascuna de
les bandes mostrades (en especial pel que fa referència
a la seua grandària i conformació).
1 2 3 4
l’hepàtic, no cedeix glucosa a la circulació sanguínia perquè en el teixit muscular
no hi ha activitat enzimàtica glucosa- 6 - fosfatasa (vegeu la figura).
L’objectiu és estudiar la degradació de sucres en condicions anaeròbies
(fermentació alcohòlica de la glucosa pel llevat Saccharomyces cerevisiae ) i
determinar el contingut de glicogen extret a partir de teixit hepàtic.
Protocol experimental
1. Materials i reactius
—Vas de precipitats de 50 mL —Vareta de vidre
—Pinces d’acer inoxidable i tisores —Bany a 100 ºC
—Centrifugadora —Tubs de centrifugadora (2)
—Sacarímetre —Colorímetre
—Tubs d’assaig i boles de vidre (7) —Pipeta automàtica, P1000 i puntes
—KOH (300 g/litre) —NaOH 0,5 M
—HCl 1,2 M —Na 2
SO
4 saturat
—Etanol absolut fred —Glucosa 2,5 mM (0,46 g/L)
—Llevat de forner (20 g/sessió) —Teixit hepàtic de conill (7 g/sessió)
—Pipetes d’1, 2, 5 i 10 mL i propipetes
—Glucosa a l’ 1 % (p/v) (acabada de preparar pel professor per a tots els grups,
200 mL) en tampó acetat 0, 2 M pH 5,5 desgasificat.
—Tampó acetat 0, 2 M pH 5,5 (6,06 g d’acetat sòdic i 0,39 mL d’àcid acètic
glacial en 250 mL d’aigua).
—Reactiu 3,5-dinitrosalicilat (3,5-DNS). Es prepara de la manera següent:
dissoldre 5 g de 3, 4 - DNS amb 300 mL d’aigua destil·lada a 50 ºC en
agitació; afegir-hi 50 mL de NaOH 4 M i mesclar bé. Afegir 150 g de tartrat
sodi-potàssic i, una vegada ben dissolt, afegir-hi aigua destil·lada fins
completar 500 mL.
2. Procediment
2.1. Fermentació alcohòlica de la glucosa
Es prepara una suspensió de 2 g de llevat en 20 mL de glucosa a l’ 1 % (p/v)
en un vas de precipitats. Es mescla ràpidament amb la vareta i immediatament
després, amb l’ajuda d’una pipeta, se n’aboquen 14 mL en el sacarímetre amb la
precaució que el tub estiga completament ple.
Preneu nota de l’aparició de bombolles i de la formació de CO 2
(volum de
líquid desplaçat en el sacarímetre) al llarg del temps, aproximadament cada 10
min fins recollir-ne 7 mL.
Feu una representació gràfica dels mL de gas (CO 2 ) produïts (ordenades)
davant del temps (min, en abscisses). Discutiu-ne els resultats.
2.2. Quantificació del glicogen en teixit hepàtic
En un primer pas, s’obté el glucogen a partir del teixit hepàtic de conill. A
continuació, es procedeix a hidrolitzar aquest glicogen per tal de determinar, per
reacció colorimètrica amb el 3,5-dinitrosalicilat (3,5-DNS), la quantitat de
glucosa que conté.
2.2.a. Obtenció del glicogen
Es col·loquen 0,7 g de fetge en un tub de centrifugadora. S’hi afegeixen 2
mL de KOH, es tapa amb una boleta de vidre i s’escalfa en un bany en ebullició
durant 20 min, agitant de tant en tant la mescla. Es refreda el tub amb gel. S’hi
afegeixen 0,4 mL del Na 2
SO
4
saturat i 5 mL d’etanol absolut fred. Es mescla bé,
es tapa amb parafilm i es deixa reposar 5 min en gel. El glicogen sedimentat
s’arreplega en el sediment de la centrifugació a 3 000 rpm durant 10 min. El
sobrenadant se separa per decantació. El glicogen sedimentat es dissol afegint-hi
1,0 mL d’aigua. Si és necessari, escalfeu suaument fins a la dissolució completa
del glicogen.
2.2.b. Hidròlisi del glicogen
(b) L’absorbància obtinguda en una mostra de glicogen hidrolitzat de fetge de
conill, després de reaccionar amb 3,5-DNS, fou de 0,147 nm.
(c) Els polisacàrids s’hidrolitzen escalfant-los a 100 ºC en medi àcid.
3. Es realitza una extracció de glicogen partint de 2 g de fetge de rata, i
seguidament el glicogen s’hidrolitza amb HCl en un volum total de 5 mL. Per tal
de valorar el contingut en glucosa, es prenen 0,5 mL i es realitza la reacció amb el
3,5-dinitrosalicilat (3,5 DNS), es mesura l’absorbància a 540 nm i quan
s’interpola en la corba patró, s’obté un valor de 0,9 mg de glucosa. Quina
quantitat de glucosa hi ha per gram de teixit?
4. En un experiment de valoració de glicogen en el fetge i en el múscul esquelètic
procedent de rates sotmeses a dejuni i de rates control que no deixaren de menjar,
s’obtingueren els resultats següents en mg de glucosa per g de teixit:
Control Dejuni
Fetge 40, 6 1, 2
Múscul 0, 1 2, 0
Si considerem que no hi ha cap errada experimental i que una de les rates es
va escapar i va ser capturada i sacrificada després d’algunes hores de persecució,
quina és la justificació bioquímica d’aquests resultats?
5. En la sessió pràctica de laboratori heu determinat la quantitat de glicogen
present en el teixit hepàtic de conill en mg de glucosa per g de teixit. Com faríeu
per expressar aquestes dades en mg de glicogen per g de teixit?
6. En la determinació de glicogen realitzada, esteu segur que la glucosa que
quantifiqueu prové exclusivament del glicogen? Expliqueu-ho.