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I. OBJETIVOS
- Conocer el uso de una curva de calibración.
- Aprender a construir una curva de calibración.
- Aplicar la curva de calibración en los análisis cuantitativos. II. INTRODUCCIÓN Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado de calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”. Una curva de calibración es la representación gráfica que relaciona una señal instrumental en función de la concentración de un analito. La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y” (variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la ecuación.
La curva de calibración, nos muestra el conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deberá cuantificar el compuesto por analizar, es decir es importante que la señal y concentración de la muestra problema se encuentre en el intervalo de la señal y concentración del patrón. Figura 1. De modo que si los valores de señal de la muestra se encuentran fuera de los valores encontrados en la curva de calibración se deberá proceder a una dilución de la muestra a fin de reducir la señal del mismo.
Figura 1. Representación gráfica de la curva de calibración, se muestra puntos de la curva de calibración (patrón) y un punto de la muestra de ensayo, la cual está dentro de los valores tanto de respuesta como de concentración de la curva de calibración. A fin de asegurar que la recta encontrada con los puntos experimentales se ajuste correctamente al modelo matemático de la ecuación se calculan los valores de la ordenada al origen, la pendiente y el coeficiente de determinación (𝑟^2 ). Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadísticamente se requieren por los menos tres para que la curva sea confiable; este número se suele aplicar a métodos de rutina perfectamente establecidos y validados. Sin embargo, si el método está en una etapa de desarrollo, el número de puntos mínimo será de cinco o seis para que la variabilidad sea mínima y el intervalo lineal sea suficiente. Un aumento en el número de puntos experimentales implica mayor fiabilidad en la recta de calibrado. La verificación del comportamiento de un analito mediante una curva de calibración requiere un mínimo de cinco puntos para un intervalo de confianza del 95 % y de ocho puntos para uno del 99 %. Cabe mencionar que es muy importante efectuar la medida del “blanco” Se llaman disoluciones blanco o simplemente blancos a las disoluciones que contienen todos los reactivos y disolventes usados en el análisis, pero sin el analito. Los blancos miden la respuesta del procedimiento analítico a las impurezas o especies interferentes que existan en los reactivos o, simplemente, a las especiales características del instrumento de medida. La medida de la señal del blanco puede realizarse: a. Registrando directamente la señal del blanco e incluir este punto experimental en la recta de calibrado con x=0 como señal del blanco. b. Restando a la señal medida con el analito, la señal media de varias lecturas del blanco (señal observada – blanco). Para demostrar la linealidad se requieren cumplir ciertos criterios de aceptación en la que estadísticamente se puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular: ● La pendiente (m) ● La ordenada al origen (b)
Pesar 10 mg de permanganato de potasio y llevar a una fiola de 250 mL, posteriormente llevar a volumen con agua. b. Preparación de soluciones patrón: Preparar las soluciones a las siguientes concentraciones: 4ppm, 8 ppm, 12 ppm, 16ppm y 20 ppm. Fiolas 1 2 3 4 5 Solución madre (40 ppm) 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL Aforo con agua destilada 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL Concentración, ppm 4ppm 8 ppm
ppm
ppm
ppm A continuación, los cálculos: Concentración de la fiola 1: Una vez preparadas las soluciones patrón se procede a leer las absorbancias (en el caso de usar un espectrofotómetro) a la longitud de onda óptima.
[ ] ppm Absorbancia 4 0. 8 0. 12 0. 16 0. 20 0. Seguidamente realizar una gráfica en Excel o papel milimetrado, en el eje “X” se considera a la concentración y en el eje “Y” la absorbancia, posteriormente conseguimos la ecuación de la recta y la 𝑟^2 (usando el Excel o la calculadora). El gráfico debe llevar, nombre de la curva, nombre de los ejes, en el caso de la concentración se debe señalar las unidades. Una de las utilidades que tiene la realización de la curva de calibración, es que nos ayuda a encontrar la concentración de una muestra problema:
b. Gráficamente Al realizar la medición de una muestra, lo que se obtiene es una respuesta instrumental (absorbancia) que se interpola en la curva de calibración, esto permite obtener la concentración del analito. Del ejemplo anterior: c. Factor de calibración (FC) Para hallar el factor de calibración dividimos concentración entre la señal (absorbancia) de las soluciones patrón y determinamos el promedio, para encontrar la concentración de las muestras multiplicamos el Fc por la absorbancia de las muestras.
Del ejemplo anterior: [ ] ppm Absorbancia Fc=[ ]/ abs 4 0.154 25. 8 0.311 25. 12 0.464 25. 16 0.621 25. 20 0.774 25. Promedio FC= 25. Calculamos la concentración de las muestras: Si comparamos los resultados, tenemos lo siguiente: M1 M2 M Con la ecuación 6.55 ppm 14.95 ppm 18.07 ppm Gráficamente 6.5 ppm 14.9 ppm 18.1 ppm Factor de calibración 6.65 ppm 14.98 ppm 18.10 ppm Observamos que los resultados son iguales por cualquiera de las formas. III. MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS
- Vasos de precipitado
- Pipeta
- Probetas
- Matraz aforado
- Espectrofotómetro
- Cubetas
- Balanza analítica Muestras [ ] ppm Absorbancia M1 0. M2 0. M3 0.
Experiencia N° 02: Curva de calibración de Hidroclorotiazida.
- Pesar 12.5 mg de estándar de hidroclorotiazida, colocar en una fiola de 25 mL, agregar 10 mL de alcohol 96°, disolver mecánicamente por 10 minutos, llevar a volumen con alcohol 96°. De esta solución preparar soluciones patrón con las siguientes concentraciones: 0.01 mg/mL, 0.02 mg/mL y 0. mg/mL, en fiola de 25 mL, llevar a volumen con alcohol 96°.
- Leer la absorbancia (a la longitud de onda optima que se determinó en la práctica 03) de las soluciones patrón.
- Realizar la gráfica de Concentración Vs Absorbancia y determinar la ecuación de la recta. Modus operandi: Pesar 4 tabletas de hidroclorotiazida Agregar alcohol de 96°para disolver 50ml 25ml 25ml Tomar 1.5ml de la solución madre y agregar alcohol de 96° Solución madre Llevar al espectrofotóm etro a leer
V. RESULTADOS
Experiencia 1 Lectura de absorbancia: uM, Permanganato de K Abs 40 0. 100 0. 160 0. 190 0. 220 0. 250 0. 280 0. 320 0. 360 0. Gráfica de Concentración Vs Absorbancia y determinar la ecuación de la recta Ecuación de la recta
VI. DISCUSION
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida por la misma^1. El espectrofotómetro es un equipo que se usa en los laboratorios para determinar cuál es el haz de radiación electromagnética o luz y así identificar, calificar y cuantificar cómo es su intensidad. De la misma manera, permite determinar cuál es su eficiencia, sensibilidad, resolución y rango espectral. Los cuales dependerán de las variabilidades del diseño y de la elección de los componentes ópticos que contiene. El espectrofotómetro sirve básicamente para conocer cuál es la concentración de las sustancias en una solución^2. La curva de calibración es la representación gráfica que relaciona una señal instrumental en función de la concentración de un analito y define un intervalo de trabajo en el cual, los resultados a informar tienen una precisión y exactitud conocida que ha sido documentada en la validación de cada método. Se considera que pasa el control de calidad, si se presenta una respuesta lineal con R2 > 0, y una desviación estándar relativa ≤ 20%. Luego, al momento de realizar la medición de una muestra, lo que se obtiene es una respuesta instrumental que se interpola en la recta de calibración, esto último permite obtener la concentración del analito. VII. CONCLUSION
- Se conoció el uso de una curva de calibración, realizando varios ejemplos como es el caso de captopril que usamos como analito de estudio
- Se aprehendió a construir una curva de calibración.
- Se aplicó la curva de calibración en los análisis cuantitativos de Captorpil e Hidroclorotiazida.
VIII. CUESTIONARIO
Se desea determinar captopril, en tabletas de capoten ® 25mg, para ello la muestra se preparó de la siguiente manera: del pulverizado de 20 tabletas de captopril cuyo peso promedio fue de 75.23 mg, se pesó 310.25 mg que se llevó a una fiola de 25 mL, de ella de tomo 10 mL y se llevó a una fiola de 20 mL Determinar la concentración de la muestra problema (en mg/tableta) usando la ecuación de la curva de calibración, Factor de calibración y gráficamente. La Lectura de la absorbancia del estándar son las siguientes. [ ] mg/mL Absorbancia 1.00 0. 2.00 0. 3.00 (^) 0. 4.00 (^) 0. Muestra 0. Grafica absorbancia Vs Concentración del estándar Determinando la concentración: Y = 0.2056 X + 0. = 0.2056 C + 0. C =
- 525 + 0. 024
- 2056 C = 2,6702 mg/ml
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Díaz NA, Ruiz JAB, Reyes EF, Cejudo AG, Novo JJ, Peinado JP, et al. 8. Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
- ¿Cómo funciona un espectrofotómetro? [Internet]. Kalstein. [citado 19 de enero de 2023]. Disponible en: https://www.kalstein.com.pa/medir-metodos- de-oxigeno-disuelto/
