Grado en Biotecnología-Prácticas de Microbiología
1
PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
GRADO BIOTECNOLOGÍA
2º CURSO
Profesora: Rosario Haro Hidalgo
Belén Brito López
Laboratorio de Microbiología
Departamento de Biotecnología
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Asignatura: Microbiologia, Profesor: , Carrera: Biotecnologia, Universidad: UPM
Tipo: Ejercicios
2012/2013
1 / 24
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PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA
GRADO BIOTECNOLOGÍA
2º CURSO
Profesora: Rosario Haro Hidalgo
Belén Brito López
Laboratorio de Microbiología
Departamento de Biotecnología
NORMAS GENERALES DE USO EN EL LABORATORIO
Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales de funcionamiento:
- Cada alumno deberá venir provisto de una bata de laboratorio que será imprescindible para realizar todas las prácticas.
- Es necesario leer detenidamente el guión de prácticas antes de comenzar a trabajar.
- El alumno debe anotar los resultados obtenidos en el cuaderno que se entregará al finalizar las prácticas para su evaluación.
- Antes de sacar los microscopios es imprescindible apagar el fuego de los mecheros.
- Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben retirarse y comprobar que se han apagado al final de cada práctica.
- Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como los microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
- Todos los materiales de desecho deben colocarse en bolsas de autoclave para su esterilización. Los cubres y portas usados se colocarán en un recipiente para vidrio situado en las pilas.
- El orden y la limpieza son esenciales en todos los experimentos y trabajos de laboratorio. Al terminar cada práctica cada alumno limpiará cuidadosamente el material que ha utilizado, y lo guardará en su taquilla y los objetivos del microscopio se limpiarán con un papel impregnado en alcohol.
- Es conveniente lavarse las manos con jabón antes de dejar el laboratorio.
- Se avisará a los profesores encargados de cualquier accidente, ausencia o rotura de material de laboratorio.
1.1 Equipamiento de laboratorio
Objetivo: Conocer los equipos esenciales de un laboratorio de Microbiología.
Se enseñará el manejo de los autoclave, estufas, balanzas, pH metros, campanas de flujo laminar y
agitadores del laboratorio necesarios para la preparación de los medios de cultivo de
microorganismos. Completar esta parte con apuntes de clase.
Composición del medio de cultivo empleado (medio UNIVERSAL) en g/litro: glucosa, 5; extracto de
levadura, 5; peptona, 5; extracto de carne, 5; fosfato dipotásico, 2; para solidificar se añaden 15 g/l de
agar.
Cabina de flujo laminar Esquema de funcionamiento del autoclave
1.2. Siembras de Microorganismos (1ª parte).
Objetivo: La familiarización con las técnicas más habituales de siembras de microrganismos en el
laboratorio de Microbiología en medios sólidos y líquidos.
En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una
población de microorganismos, denominada entonces inóculo, de un cultivo crecido a un medio
nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y en condiciones asépticas. La principal advertencia consiste en trabajar
siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que
SESIÓN 1
1.3.1. Microorganismos aerobios: técnica de estría en placa. Siembra por agotamiento
Para obtener colonias aisladas por la técnica del agotamiento la muestra se extiende sobre la
superficie según se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra “por agotamiento”,
la cantidad de inóculo sea lo suficientemente bajo como para que se depositen células aisladas y
distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales aparecerán colonias aisladas tras el
periodo de incubación.
1.3.2. Microorganismos anaerobios facultativos: dilución y vertido en placa.
A partir del cultivo en caldo se tomará con el asa una gota de cultivo y se suspenderá en un tubo
con 9 ml de agua. A partir de esta dilución se inoculará un medio sólido (Medio Universal) que se
mantendrá fundido en un baño a 45ºC. El contenido del tubo se verterá en una placa Petri vacía
y se agitará con movimientos circulares y transversales para distribuir el inóculo bacteriano.
1.4 Observación al microscopio de microrganismos I: preparaciones en fresco
Objetivo: Familiarización con el uso y manejo del microscopio óptico de campo claro para la observación
de microrganismos.
Principios generales de manejo del microscopio óptico. PRECAUCIONES a tener en cuenta
- Apagar el mechero cuando se use el microscopio
- no dejar encendida la luz del microscopio mientras no se use.
- El objetivo x100 es un objetivo (el único) de inmersión , que se utiliza siempre con aceite.
- Una vez utilizado, se limpia con papel manila (no de filtro) impregnado con un poco de alcohol.
Preparación en fresco de microorganismos.
Se realizarán preparaciones en fresco de levaduras. Para ello se colocará una gota de agua en el
portaobjetos de cristal y donde se suspenderá una pequeña cantidad de cultivo. Se tapará con un
cubreobjetos y se observará al microscopio, con los objetivos de 10x, 40x y 100x. Como son muestras
con muy poco contraste es muy importante la buena utilización de la luz, con objetivos de menor
aumento utilizad baja intensidad e id aumentando progresivamente a medida que se cambia
objetivos de mayor aumento.
- Inocular un matraz con 20 ml de cultivo a partir de un cultivo bacteriano en fase estacionaria. En el
matraz inoculado se debe observar una ligera turbidez después de la inoculación.
- Antes de incubar el matraz, se toma una muestra para medir la absorbancia (D.O.600) inicial utilizando
cubetas de plástico de 1 ml. Esta medida será la absorbancia inicial correspondiente al tiempo=0.
- Incubar el matraz a 37ºC en agitación.
- Realizar medidas periódicas de D.O.600 a distintos tiempos (aprox. cada 30 min) y llevar los datos a la
gráfica lineal de D.O./tiempo (en evaluación de los aprendizajes).
En paralelo, se realizará una estimación de la población mediante un método directo por determinación
del número de viables, correspondiente a dos D.O. del cultivo. Este conteo de microrganismos se hará
mediante dilución y siembra en placa. Esta técnica se basa en la realización de diluciones decimales
seriadas del cultivo y la inoculación de diferentes diluciones en placas con medio universal en
profundidad. El medio se agita bien al verterlo en la placa de manera que se puedan obtener colonias
aisladas tras el periodo de incubación. El número final de microrganismos se obtendrá de multiplicar el
número de colonias obtenidas por el factor de dilución utilizado. Esta técnica permite conocer el
número de microrganismos viables ya que sólo vamos a contar aquellos que han sido capaces de
dividirse y formar colonias, por lo que a veces se enumeran como UFC (unidades formadoras de
colonias).
De forma que según el esquema que se muestra a continuación. Inocular 0,1 ml de diluciones 10-5, 10 -6,
y 10 -7^ en profundidad en placas a las que se añadirá medio universal. Las placas se incubarán a 37ºC y se
contarán las colonias formadas al día siguiente.
Esquema para realizar el conteo de viables
3.1. Aislamiento de microorganismos (3ª parte).
Observación de los crecimientos en estría y picadura procedentes del aislamiento de microorganismos,
se comprobará que son cultivos puros por observación al microscopio.
3.2. Determinación del crecimiento microbiano. Conteo de viables (2ª parte).
Para obtener el número de microrganismos del cultivo por la técnica de dilución y siembra en placa, se
efectuarán los conteos de colonias de las placas correspondientes a las diferentes. Serán fiables placas
con un número de colonias entre 30-300 ufc/placa. Con estos datos se calcula el Nº inicial de UFC/ml,
multiplicacando Nº de colonias por el factor de dilución. Anotar resultados en la lista general y en el
cuaderno. Con estos datos cada grupo debe calcular el tiempo de generación de su cultivo. Los
resultados se discutirán en la sesión siguiente.
3.4. Conteo de microrganismos en agua. Técnica del Numero Más Probable. (1ª parte)
Objetivo: Aprender a utilizar la técnica de recuento de microrganismos del NMP utilizada para muestras muy diluida o con una baja carga microbiana.
Esta técnica permite cuantificar el número de microorganismos presentes en un sustrato (generalmente líquido) cuando dicho número estimado es relativamente bajo (entre 3 y 1000 bacterias por 100 ml, aprox.). Para ello se realizan series de diluciones sucesivas de forma que se llegue a un “punto de extinción” de la población microbiana, esto es, a unas diluciones en las que la probabilidad de que quede 1 microorganismo en la dilución sea relacionable estadísticamente con la población inicial.
En esta práctica se va a utilizar la técnica del NMP para detectar y cuantificar realizará la presencia de Escherichia coli en unas muestras de agua. E. coli es una bacteria de origen fecal, y se utiliza en el análisis de aguas y alimentos como microrganismo indicador de contaminación fecal. Para ello se han preparado dos condiciones de crecimiento selectivas para detectar esta bacteria
1-El medio de cultivo contiene Lactosa como fuente de Carbono y energía porque se sabe que E. coli puede utilizar este azúcar fermentando, y otras bacterias relacionadas no.
2-Se debe detectar la producción de gas durante el crecimiento, como señal de que el azúcar se está utilizando en una fermentación. Para ello los tubos se les ha añadido una campana de cristal.
SESIÓN 3
3.5 Observación microscópica de microorganismos: Tinción simple.
Se realizará la Tinción sobre bacterias de acuerdo al siguiente método.
- Suspender el microorganismo en una gota de agua en porta.
- Secar al aire o en platina de Koch.
- Fijar con calor a la llama (sin sobrecalentar).
- Teñir con violeta cristal durante 1 min.
- Lavar con agua y secar suavemente con papel de filtro.
- Observar al microscopio
Extender la muestra sobre un porta
Secar al aire
Fijar la muestra a la llama
Teñir con colorante Lavar, Secar
Depositar una gota de aceite Examinar al objetivo 100x
4.1. Determinación del crecimiento microbiano por turbidimetría (3ª parte).
Análisis de los resultados.
Se discutirán los resultados de las curvas de crecimiento obtenidas por turbimetría y se correlacionarán con el resultado obtenido en los conteos de viables obtenidos por la técnica de dilución y siembra en placa. Se comparará el tiempo de generación obtenido en cada caso.
4.2. Conteo de microrganismos en agua. Técnica del Numero Más Probable. (2ª parte)
Prueba Confirmativa: Se observarán los tubos de caldo lactosado inoculados a partir del agua anotando el número de tubos que aparecen con crecimiento microbiano y que han producido gas. Para confirmar que estos microrganismos son E. coli , se debe inocular (a partir de uno de los tubos positivos) un tubo en medio verde brillante y una placa de medio eosina-azul-metileno, que son medios selectivos y diferenciales para esta bacteria. Se incubarán a 42 y 37ºC respectivamente.
Medio Bilis verde brillante : lactosa 10 g., peptona 10 g; oxgall (extracto de vesícula bovina) 20 g., verde brillante, 0,0133 g; agua, 1000 ml.
Medio Eosina azul de metileno (EAM) : lactosa, 10 g; peptona, 10 g.; fosfato dipotásico, 2 g.; eosina, 0,4 g.; azul de metileno, 0,06 g; agar, 15 g.; pH 7,2. agua, 1000 ml; pH, 6.8.
SESIÓN 4
Al día siguiente, se tomará cada filtro con las pinzas (flameadas con alcohol en condiciones de esterilidad), se introducirá en sendos tubos estériles rotulados, a los que se añadirán 2 ml de solución salina 0,85%. Agitar intensamente y extender 10 y 100 μl en dos placas de TY suplementado con Nitrofurantoina y Tetraciclina (5). Dejar crecer a 28ºC durante toda la noche.
4.4. Antibiograma. Ensayo de Difusión en Disco (1ª parte)
Objetivos: Determinar la sensibilidad de las bacterias a antibacterianos y saber iInterpretar los resultados de los ensayos de difusión en agar.
La detección y cuantificación de la sensibilidad a un antibacteriano es una prueba con múltiples usos en bacteriología. Desde el punto de vista práctico lo más habitual es su empleo terapéutico aunque también puede utilizarse con fines taxonómicos y experimentales. La actividad antibacteriana puede cuantificarse con varios métodos que definen la menor concentración de la sustancia que impide el crecimiento ( concentración mínima inhibidora, CMI).
En esta práctica se realizará el método de difusión en agar de Bauer and Kirby para detectar la actividad antibacteriana de ciertos compuestos y la resistencia bacteriana a ellos. En la prueba de difusión de discos en agar se utilizan discos impregnados con concentraciones conocidas de los antibacterianos de uso frecuente. Cuando los discos se depositan sobre una placa de medio sólido inoculada con un cultivo bacteriano en profundidad o en superficie, los antibacterianos difunden hacia el medio creando un gradiente de concentración, desde el lugar de aplicación del disco hacia la periferia. Cuando las bacterias se encuentran con concentraciones superiores a la CMI pueden morir (efecto bactericida) o disminuir su velocidad de crecimiento (efecto bacteriostático), lo que se visualiza por la ausencia de crecimiento de la bacteria. A esta región se le denomina zona de inhibición. El método a seguir es:
- Una suspensión bacteriana de D.O. 600 conocida se diluirá en tubos de medio LB fundido hasta una D.O. 600 igual a 0,05. Se realizará un vertido en placa y se esperará a que el medio solidifique. Alternativamente se puede extender en la superficie de las placas de medio LB mediante un rastrillo estéril a la llama, un volumen de inóculo bacteriano. En ambos casos la cantidad de inóculo se determinará midiendo la D.O. 600 del cultivo bacteriano por turbidimetría.
- Sobre la superficie del medio de cada placa se colocarán discos impregnados en agua(como control), ampicilina, kanamicina, lejía y betadine
- Las placas se incubarán a 37º durante 24 horas y se colocarán en frio hasta su lectura.
Medio LB (Luria Bertani): 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15g de bacto agar, y agua destilada hasta 1000 ml.
5.1. Conteo de microrganismos en agua- Discusión de resultados
Observar el resultado de la prueba confirmativa la producción de gas en verde brillante y el brillo verde metálico de las colonias en el medio EAM confirma la presencia de E. coli en las muestras de agua, por el contrario si las apariencias de las colonias en EAM son blancas podráia ser otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Consultar las tablas de probabilidades para conocer el NMP de las respectivas muestras (ver Anexo).
5.2. Transferencia genética entre bacterias Gram (-). Conjugación bacteriana (2ª parte)
Confirmar la aparición de colonias únicamente en las conjugaciones 1 y 2. Contar las colonias. Explicad los resultados obtenidos en el cuaderno de prácticas.
5.1. Antibiograma. Ensayo de Difusión en Disco (2ª parte)
Medida de los diámetros de las zonas de inhibición alrededor de los filtros que aparecen como resultado del crecimiento de los microorganismos en la placa. Interpretación de los resultados. A mayor diámetro de la zona de inhibición mayor susceptibilidad a ese antibacteriano.
5. 4. Observación al microscópio de microorganismos: Tinciónes diferencial-estructural
5.4.1- Tinción diferencial: Tinción de Gram
La tinción Gram es una tinción estructural-diferencial que permite distinguir tipos de microorganismos a través de diferencias estructurales en su pared celular.
Gram positiva Gram negativa
peptidoglican peptidoglican
Membrana externa
SESIÓN 5
El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley. Las normas legales exigen:
Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son: Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml.
Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.
Estreptococos fecales: < 1 / 100ml. Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.
NMP (Número más probable). Con los intervalos del 95%, entre los cuales pueden variar para diversas combinaciones de resultados positivos y negativos
NMP (Número más probable)
Con los intervalos de confianza del 95 por 100 entre los cuales pueden variar para diversas combinaciones de resultados positivos y negativos
Número de tubos que dan reacción positiva entre
Indice NMP/100ml
Límite de confianza del 95 por 100
3 tubos de 10 ml
3 tubos de 1 ml
3 tubos de 0,1 ml Límite inferior^ Límite superior 0 0 1 3 <0,5 9 0 1 0 3 <0,5 13 1 0 0 4 <0,5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 28 10 149 3 0 0 23 4 120 3 0 1 39 7 130 3 0 2 64 15 379 3 1 0 43 7 210 3 1 1 75 14 230 3 1 2 120 30 380 3 2 0 93 15 380 3 2 1 150 30 440 3 2 2 210 35 470 3 3 0 240 36 1300 3 3 1 460 71 2400 3 3 2 1100 150 4800
ANEXO: Análisis de aguas (NMP)
SESIÓN 1
Manejo equipamiento laboratorio. Indique dos materiales de laboratorio que se podría esterilizar en
un autoclave, en una estufa y a llama de un mechero.
Autoclave Estufa Mechero Material 1 Material 2
En una picadura: ¿dónde se localizarían los microorganismos aerobios, los anaerobios facultativos y los anaerobios estrictos?
Visualización bacterias y levaduras.
Calcule el tamaño mínimo de un microorganismo que resolvería en el microscopio que ha utilizado en el laboratorio suponiendo una longitud de onda de la luz de 550 nm. ¿Cuál es la máxima amplificación de su microscopio de laboratorio?