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Departamento de Biología Molecular
Prácticas de Bioquímica
- Información general y normas del laboratorio de prácticas 2º Curso del Grado de BIOLOGÍA
- Aislamiento de inmunoglobulinas de suero........................................................................
- 1.1. Precipitación fraccionada de proteínas.......................................................................................
- 1.2. Determinación cuantitativa de proteínas: Metodo de Lowry.....................................................
- 1.3. Cromatografía de intercambio iónico
- 1.4. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
- Química ácido-base. Valoración pH-métrica
- Actividad Butiril-colinesterasa de suero de caballo
- Aislamiento de ácidos nucleicos........................................................................................
- 4.1. Purificación de ácidos nucleicos a partir de hígado de rata.
- 4.2. Mini-preparación de ADN plasmídico.
- Amplificación de ADN mediante PCR (Polymerase Chain Reaction)
- Electroforesis en gel de agarosa........................................................................................
- Anexos
- Resultados de las prácticas....................................................................................................
Información general y normas del laboratorio de prácticas
- Es necesario aprobar las prácticas para aprobar la asignatura.
- La calificación se basará en un examen tipo test que se realizará el último día de prácticas. La nota del examen supone el 70% de la nota global de prácticas.
- La asistencia, así como la entrega de los resultados indicados por los profesores y la hoja de cuestiones son obligatorias.
- La participación, ejecución y elaboración/presentación de los resultados se corresponde con el 30% de la nota global de prácticas.
- Es necesario el uso de la bata y gafas protectoras (a suministrar por los alumnos). Se indicará cuando es necesario el uso de guantes (suministrados por la universidad).
- No se puede comer, beber, fumar dentro del laboratorio
- No se puede salir del laboratorio sin haber informado al profesor responsable.
- Antes de tirar cualquier material utilizado, preguntad, pues en muchos casos es necesaria una adecuada separación de residuos.
- Cada día se lavará el material utilizado. Los tubos graduados de polipropileno (falcon) se lavan. Los tubos de 1,5mL (eppendorf) y los de poliestireno no graduados (tapón rojo) se tirarán a la basura; si se requiere separación de residuos tóxicos se os advertirá previamente.
- Se han de rotular bien los tubos para su identificación con rotulador excepto en el caso de los tubos falcon, en los que se utilizará cinta adhesiva que colocaremos en la parte superior del tubo (lo más cercano al tapón).
• Cada día, al terminar, se dejará el lugar de trabajo limpio y recogido.
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1.1. Precipitación fraccionada de proteínas
Cuando se aumenta la concentración de sal gradualmente en una disolución de proteínas, se produce inicialmente un incremento de la solubilidad de las mismas (solubilización por salado o "salting in"). Este aumento inicial en la solubilidad se debe a la estabilización en solución de la proteína por la disminución de los coeficientes de actividad de los grupos ionizables. A medida que la fuerza iónica se eleva, por aumento en la concentración en la sal, se alcanza un máximo de solubilidad seguido de una disminución hasta que las proteínas precipitan (precipitación salina o "salting out") (Figura 2). La precipitación es el resultado de la competencia por las moléculas de agua de solvatación entre la proteína y la sal, por lo que las interacciones proteína-proteína aumentan, produciéndose su precipitación. El sulfato amónico, (NH 4 ) 2 SO 4 , tiene una gran solubilidad (superior a 700 g/L) y es la sal más utilizada para el fraccionamiento de proteínas.
Figura 2. Solubilidad de las proteínas en función de la concentración de sal.
Material y reactivos
- Suero de ternera (ST).
- Disolución saturada de (NH 4 ) 2 SO 4 (100% de saturación).
- Tampón Tris-HCl 10mM, pH 7,4.
Método 1.- Realizar una dilución 1/6 del ST en tampón Tris-HCl (10mM, pH 7,4). Preparar un volumen final de 6 mL en un tubo de tapón rojo. Transferir 5mL de la dilución a un tubo falcon graduado de 15mL. La adición de (NH 4 ) 2 SO 4 se va a realizar añadiendo el volumen suficiente (lentamente, y a 4°C) de disolución saturada hasta alcanzar la concentración que se desea. Para determinar la cantidad de sulfato amónico a añadir se utilizará la siguiente ecuación: V´ (S 2 -S 1 ) V = ---------------- (1 - S 2 ) siendo, V = Volumen que hay que añadir a la muestra proteica de la disolución saturada de sal para conseguir una concentración final de sal de S 2. V´= Volumen de muestra que se tiene.
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S 2 = Tanto por uno de saturación a la que se quiere llevar la muestra. S 1 = Tanto por uno de la concentración inicial de sulfato amónico en la muestra. 2.- Calcular el volumen que hay que añadir de (NH 4 ) 2 SO 4 saturado a 5mL de la dilución
1/6 de ST para llevarla hasta un 30% de saturación. Mezclar lentamente en frío, e incubar 10 minutos en hielo para precipitar las proteínas. 3.- Sedimentar las proteínas por centrifugación a 2.800xg (3.500rpm) durante 10 minutos a 4°C. 4.- Transferir el sobrenadante (SB1) a un tubo graduado y guardar el precipitado de proteínas ( fracción 1 ) a 4ºC.. 5.- Calcular el volumen que hay que añadir de (NH 4 ) 2 SO 4 saturado al SB1 para llevarlo hasta un 40% de saturación. Mezclar lentamente en frío, e incubar 10 minutos en hielo para precipitar las proteínas. 6.- Sedimentar las proteínas por centrifugación a 2.800xg (3.500rpm) durante 10 minutos a 4°C. 7.- Transferir el sobrenadante (SB2) a un tubo graduado y guardar el precipitado de proteínas ( fracción 2 ) a 4ºC. 8.- Calcular el volumen que hay que añadir de (NH 4 ) 2 SO 4 saturado al SB2 para llevarlo hasta un 60% de saturación. Mezclar lentamente en frío, e incubar 10 minutos en hielo para precipitar las proteínas. 6.- Sedimentar las proteínas por centrifugación a 2.800xg (3.500rpm) durante 10 minutos a 4°C. 7.- Retirar el sobrenadante (SB3) y guardar el precipitado de proteínas ( fracción 3 ) a 4ºC. 8.- Resuspender cada fracción en 6mL de Tris 10mM, pH 7,4 y conservar a 4°C hasta su utilización en el siguiente ensayo.
1.2. Determinación cuantitativa de proteínas: Metodo de Lowry
El objetivo de la práctica es calcular la cantidad total de proteínas contenida en una disolución. Existen diferentes métodos para el cálculo de la concentración de proteínas, entre los que se encuentra el método de Lowry, descrito en 1951 y que es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Este método consta de dos etapas:
- Se añade el reactivo 1, que contiene iones Cu2+^ en medio alcalino que se unen a las proteínas formando complejos de coordinación con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos (Figura 3). Además, los iones Cu2+^ provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.
Proteína NaOH CuSO (^4)
a b
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10 volúmenes de Na 2 CO 3 al 2% en NaOH 0,1 M. 0,1 volúmenes de tartrato sódico potásico al 2% (KNaC 4 H 4 O 6 ). 0,1 volúmenes de CuSO 4 al 1%.
- Reactivo 2: 1 volumen de reactivo de Folin. 1 volumen de H 2 0 destilada.
Método A partir de una disolución de albúmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/mL de concentración, preparar 8 diluciones, con Tris-HCl 10mM pH 7,4, de concentraciones: 0, 20, 40, 80, 160, 240, 320 y 400 μg/mL siguiendo las indicaciones de las columnas 3 y 4 de la tabla adjunta. En paralelo, preparar otros 8 tubos con 0,25 mL de cada una de las siguientes muestras diluidas:
- ST (diluido 1/6): 1/150; 1/
- Fracción 1: 1/2; 1/
- Fracción 2: 1/30; 1/
- Fracción 3: 1/30; 1/
A cada uno de estos 16 tubos, añadir NaOH 1 M hasta una concentración final de 0,1M (25 μL). Añadir a cada tubo 2mL del reactivo 1, mezclarlo bien e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Añadir ahora 0,225 mL del reactivo 2, mezclarlo bien e incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente (ver tabla).
Para medir la absorbancia de las muestras utilizaremos un espectrofotómetro (Figura 5), que nos encontraremos ya encendido y en el que habrá que seleccionar la longitud de onda de 750nm.
Figura 5. Esquema básico de un espectrofotómetro.
Los pasos a seguir son los siguientes:
- Volcar el contenido del tubo 1 (blanco ‘sin proteína’) en la cubeta y colocarla en la posición seleccionada dentro del espectrofotómetro.
- Ajustar la lectura a cero (“Set Ref” o “Medir Blanco”, según espectrofotómetro).
- Devolver el contenido de la cubeta a su tubo original.
- Lavar la cubeta con agua destilada.
- Volcar en la cubeta limpia y seca el contenido de la siguiente muestra (tubo 2).
- Sin modificar ningún parámetro, anotar la lectura de la absorbancia.
- Repetir los pasos 3-6 para medir la absorbancia del resto de muestras.
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Figura 6. Representación de los valores de absorbancia frente a la concentración. Aparece indicada la zona ‘lineal’ en la cual el valor de absorbancia (se ajusta a una recta) es proporcional a la concentración de proteína.
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1.3. Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico de proteínas tiene su fundamento en las propiedades ácido-base de éstas. Las proteínas tienen una carga neta determinada por su composición aminoacídica y por el pH del medio en el que se encuentran. El carácter y magnitud de esta carga neta les permite interaccionar o no con un grupo cargado. El comportamiento de una proteína en una cromatografía de intercambio iónico puede predecirse a partir de su punto isoeléctrico (pI). Una proteína con un pI de 5,8, tendrá una carga neta positiva a valores de pH inferiores a su pI, y negativa a pH superiores. Atendiendo al pI de la proteína y a los valores de pH con los que deseemos trabajar, deberemos elegir un intercambiador aniónico o catiónico. El intercambiador está constituido por una matriz insoluble y, a ser posible, inerte a la que está unida un grupo funcional con una carga positiva (cuando se trate de un intercambiador de aniones) o negativa (en el caso de un intercambiador de cationes). Un experimento cromatográfico de intercambio iónico consta de tres fases: a) Equilibrado , o ajuste de la resina y de la muestra a las condiciones salinas y de pH iniciales requeridas para el experimento; b) Fijación de la muestra , por incubación de la mezcla, en este caso de proteínas, que deseamos resolver, uniendo todas o parte de ellas para después eluirlas de forma diferencial y c) Elución de la muestra , utilizando concentraciones variables de sales y/o tampones con diferente pH. Estas tres fases van precedidas de una fase de Empaquetamiento de la resina, cuando realicemos la cromatografía en una columna, siendo innecesario cuando realicemos la cromatografía incubando directamente la resina con la muestra y luego separando la primera por decantación o centrifugación. La práctica que se realiza a continuación tiene como objetivo la purificación de inmunoglobulinas de suero de ternera a partir de un extracto parcialmente enriquecido en esta proteína por precipitación con sulfato amónico. Para ello emplearemos una resina de intercambio de aniones, el DEAE-celulosa (DEAE-Sephacel©), constituido por una matriz a la que está unido como grupo funcional un radical dietil-amino-etilo (Figura 7).
CH 2 –CH 3
CELULOSA–CH 2 –CH 2 –N+H
CH 2 –CH 3
Figura 7. Fórmula química del grupo DEAE empleado en el intercambio iónico. El procedimiento empleado será una cromatografía en columna, utilizando una solución tampón Tris-HCl a pH 8,5, que nos asegure que la carga neta de las inmunoglobulinas sea negativa y, por consiguiente, que la proteína se una de forma efectiva al intercambiador.
Material y reactivos
- Extracto correspondiente al corte del 40% de la práctica de precipitación con (NH 4 ) 2 SO (^4)
- Tampones de equilibrado/lavado y elución de la columna: *Tris-HCl 10mM, pH 8, *Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 50mM NaCl *Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 150mM NaCl *Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 300mM NaCl
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*Tris-HCl 10mM, pH 8,5, 500mM NaCl
- Resina DEAE-Sephacel©.
- Una columna cromatográfica comercial.
Método
- Empaquetamiento de la resina Colocar a la salida de la columna un trozo de conducción de goma y una llave, que nos permita interrumpir el flujo a través de la misma si lo deseamos Para empaquetar la columna, colocarla verticalmente y, dejando la salida libre, añadir resina (diluida previamente en el tampón de equilibrado) hasta que el volumen de la resina empaquetada llegue a 1 mL.
Una vez empaquetada la columna procederemos a su equilibrado en el tampón inicial de la cromatografía. Esto se lleva a cabo pasando 10 veces el volumen de la resina ( 10mL ) con tampón inicial ( Tris-HCl 10mM pH 8,5 ). De esta forma nos aseguramos que la resina se halla al pH que deseamos.
- Unión de la muestra a la resina Tomar el volumen necesario de la fracción 2 que contenga 5 mg de proteína (utilizar los resultados del ensayo de Lowry) y diluirlo en 5 volúmenes de tampón inicial, con el fin de disminuir en lo posible la concentración de sales y así asegurarnos de que la proteína se encontrará al pH adecuado para interaccionar con el intercambiador. Lavar la columna con un volumen equivalente a 4 veces el volumen de resina empaquetada (4mL) del tampón inicial para eliminar las proteínas que no se hayan unido al intercambiador. - Elución de la muestra Para separar las inmunoglobulinas de la muestra del resto de las proteínas se llevarán a cabo varias eluciones de la columna con concentraciones crecientes de NaCl en tampón Tris- HCl 10mM a pH 8,5 (Figura 8). Cada uno de los pasos se llevará a cabo con 4mL del correspondiente tampón (ver tabla), y se recogerán fracciones de 1mL que, posteriormente, se analizarán por electroforesis en gel de poliacrilamida.
TAMPON COMPOSICION VOLUMEN
1 Tris 10 mM, pH 8,5; NaCl 50 mM 4 mL (^2) Tris 10 mM, pH 8,5; NaCl 150 mM 4 mL
3 Tris 10 mM, pH 8,5; NaCl 300 mM 4 mL
4 Tris 10 mM, pH 8,5; NaCl 500 mM 4 mL
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Figura 9. Cálculo del peso molecular a partir de la migración por electroforesis en gel de acrilamida. (a) Aspecto teórico de los marcadores de peso molecular preteñidos tras haber desarrollado la electroforesis en gel de acrilamida. (b) Recta de regresión con pendiente negativa que se obtiene al representar el log 10 de los pesos moleculares de los marcadores (a) en el eje de ordenadas y la migración relativa (Rf) en el eje de abscisas. El peso molecular aproximado de la proteína problema se obtendrá por interpolación a partir de la recta de regresión utilizando para ello su migración relativa.
Figura 10. Efecto del porcentaje final de Acrilamida en el gel separador sobre la separación de las proteínas según su peso molecular. Como se puede observar, las proteínas de mayor peso molecular se separan mejor cuando el porcentaje final de acrilamida es menor, y viceversa, las proteínas de menor tamaño se separan mejor en porcentajes altos de acrilamida.
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Material y reactivos
- Disolución de acrilamida-bisacrilamida al 40% en agua destilada.
- Tris-HCl 0,5 M pH 6,
- Tris-HCl 3 M pH 8,
- SDS 10%
- Persulfato amónico al 10%
- Tampón de electroforesis (Tris 25mM pH 8,3; Glicina 192mM; SDS 0,1%)
- Tampón de ruptura (TR) (Tris 313 mM pH 6,8; SDS 10%; Glicerol 25%; mercaptoetanol 25%; azul de bromofenol 0,02%)
- Cubetas de electroforesis, cristales, fuentes de alimentación, separadores, pinzas.
- Marcadores de peso molecular de proteínas preteñidos ‘Dual Color’ (Bio-Rad) (ver figura 9)
- Solución de fijación y tinción (azul de Coomassie 0,1%; etanol 40%; ácido acético 10%)
- Solución para desteñir: Ácido acético 10%.
Método
- Preparación del gel En esta práctica se va a preparar un gel discontinuo constituido por el gel de separación o resolución y el gel de concentración o empaquetamiento. Las cantidades de cada reactivo se muestran en la tabla. Limpiar los cristales y montar el gel con los separadores en la carcasa correspondiente siguiendo las siguientes instrucciones:
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Suero de ternera (ST) Fracción 1 (precipitado del 30% de sulfato amónico) Fracción 2 (precipitado del 40% de sulfato amónico) Fracción 3 (precipitado del 60% de sulfato amónico) Fracción C50 (segunda fracción de 1 mL eluida con NaCl 50 mM) Fracción C150 (segunda y tercera fracción de 1 mL eluida con NaCl 150 mM) Fracción C300 (segunda y tercera fracción de 1 mL eluida con NaCl 300 mM) Fracción C500 (segunda fracción de 1 mL eluida con NaCl 500 mM)
En base a los valores de concentración de proteínas obtenida en el ensayo de Lowry, preparar una muestra de cada fracción de sulfato amónico con 40μg de proteína total tomando el volumen correspondiente de la fracción; añadir tampón de ruptura (5x) para que quede 1x, (este último paso se realiza con las muestras dentro de la campana extractora) (ver tabla adjunta). Preparar las muestras del intercambio iónico utilizando 80μL de cada fracción (ver tabla adjunta). Finalmente, calentar las muestras en un termobloque a 100ºC, en tubos eppendorf perfectamente cerrados y con la tapa agujereada, durante 3-5 minutos para desnaturalizar las proteínas.
Intercambio iónico Sulfato amónico 50mM 150mM 300mM 500mM PM S.T. F1 F2 F3 1.2 2.2 2.3 3.2 3.3 4.2 4. Masa (μg) -- 40 40 40 40 -- -- -- -- -- -- --
V muestra (μL) 10 80 80 80 80 80 80 80 H 2 O (μL) --^ --^ --^ --^ --^ --^ --^ -- TR 5x (μL) --^20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 V final ( μ L) 10 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
3.- Desarrollo de la electroforesis Una vez polimerizado el gel de concentración, retirar el peine con cuidado de no romper los pocillos para las muestras. Montar el gel en la cubeta de electroforesis siguiendo las instrucciones de los profesores de prácticas. Añadir tampón de electroforesis y cargar 30μL de las muestras anotando el orden. Una vez cargadas las muestras, se conectan los cables correctamente (el polo positivo, rojo, abajo y el negativo, negro, arriba) y se desarrolla la electroforesis a 40 mA hasta que el frente azul esté cerca de la parte inferior del gel. Cuando el frente esté cerca de la parte inferior del gel, se desconecta la corriente, se separan con mucho cuidado los dos cristales, se retira el gel y se coloca en un recipiente donde se fija y tiñe durante 30-45 minutos con la solución de fijación y tinción; posteriormente se retira esta solución y se añade la solución de ácido acético al 10%, en la que se incuba hasta que el gel esté completamente desteñido.
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2. Química ácido-base. Valoración pH-métrica
El control del pH es de vital importancia en todos los procesos metábolicos celulares puesto que las enzimas tienen una actividad máxima a un determinado valor de pH y disminuye bruscamente con una mínima variación del mismo. Por esta razón, los seres vivos deben mantener el pH de los fluidos intra y extracelulares a un valor constante, y lo consiguen gracias a sistemas tampón. El objetivo de esta práctica es entender qué son y cómo funcionan los sistemas de tamponamiento. Para ello definiremos primero una serie de conceptos básicos:
Ácidos: compuestos donadores de protones. Bases : compuestos aceptores de protones. Anfolitos : especies iónicas que pueden actuar como ácidos o como bases. Se denominan también anfóteras o anfipróticas. Ácidos o bases fuertes : compuestos que, en concentraciones bajas, están prácticamente ionizados por completo en solución, de modo que la concentración de H 3 O +^ u OH-^ es aproximadamente la misma que la concentración del ácido o base total. Ácidos o bases débiles : compuestos que no se disocian totalmente, de forma que la concentración de H 3 O +^ o de OH- libre depende del valor de sus constantes de disociación.
Los ácidos débiles (HA) se disocian parcialmente en el agua, produciendo su base conjugada (A-) y un protón en forma de H 3 O+:
La concentración de cada especie en el equilibrio esta definida por la relación:
donde Ka es la constante de disociación. Despejando [H 3 O+] de la ecuación:
Aplicando el logaritmo a ambos lados y la propiedad de los logaritmos para un producto se llega a:
E invirtiendo el cociente dentro del logaritmo se obtiene la ecuación de Henderson- Hasselbalch:
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Los aminoácidos comunes son ácidos débiles polipróticos (más de 1 grupo protonable) por lo que se pueden aplicar todos los conceptos anteriormente descritos (curva de valoración, pKa). Los aminoácidos neutros, entre los que se encuentran Glicina, Alanina o Treonina, se comportan como ácidos débiles dipróticos (dos grupos protonables) y tendrán dos valores de pKa, uno correspondiente al grupo carboxilo y otro correspondiente al grupo amino, ambos del carbono alfa. Los aminoácidos ácidos y básicos se comportan como ácidos débiles tripróticos (3 grupos protonables), por lo que tendrán, además del pKa del grupo carboxilo y del pKa del grupo amino del carbono alfa, otro valor adicional de pKa del grupo protonable de la cadena lateral (R). La carga neta del aminoácido vendrá dada por la suma de las cargas de los grupos protonables. En el caso de un aminoácido diprótico, como la Glicina (ver figura 18), encontramos 3 formas o especies: una forma totalmente protonada cuando se encuentra en medio ácido y cuya carga neta es +1, otra forma parcialmente desprotonada cuya carga neta es 0 y una última especie o forma totalmente desprotonada con carga neta -1.
AA+1^ <--pKa 1 --->AA^0 <--pKa 2 --->AA- pH ácido pH básico
Al valor de pH en el que el aminoácido tiene carga neta cero se conoce como punto isoeléctrico (pI). Para calcularlo se ha de conocer entre qué dos valores de pKa se encuentra la forma del aminoácido con carga neta cero. El valor del pI será la media de ambos valores ([pKa 1 +pKa 2 ]/2).
Durante la valoración de un aminoácido, partimos de la forma totalmente protonada (en medio ácido) y se añade de forma progresiva grupos OH-^ (en forma de base fuerte) para ir desprotonando gradualmente al aminoácido. La relación es ‘mol a mol’ de tal forma que necesitaremos 1mol de OH-^ para desprotonar 1 mol del grupo ionizable. Por lo tanto, para 1 mol de un aminoácido neutro (2 pKa) necesitaremos 2 moles totales de OH-^ para conseguir la forma totalmente desprotonada (AA-1).
Objetivos experimentales
La práctica que vamos a realizar consiste en obtener la curva de valoración de un aminoácido desconocido.
Curva de titulación de un aminoácido problema.
1. Realizar una curva de titulación de 10mL de una disolución 50mM de un aminoácido desconocido. 2. Sin dejar de agitar, medir su pH y anotar este valor como el pH inicial (punto 0). 3. Con una pipeta automática añadir 100μL de una solución de NaOH 0,5M. 4. Anotar el nuevo valor de pH. 5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta que el valor del pH sea constante y mayor de 13, anotando siempre el valor de pH después de cada adición de NaOH. 6. Representar los resultados con los valores de pH en el eje de ordenadas (eje Y) y en el eje de abscisas (eje X) la relación de moles de anión hidroxilo (OH-) por mol de aminoácido inicial (mol OH/mol aa). 7. De acuerdo con la tabla de valores de pKa, averiguar qué aminoácido se ha titulado.
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8. Formular las especies moleculares mayoritarias presentes en cada tramo de la curva de titulación. Tabla I. Valores de pK de los diferentes aminoácidos. Aminoácido (^) pK α-COOH pK α-NH 3 +^ pK R Gly 2,34 9, Ala 2,34 9, Val 2,32 9, Leu 2,36 9, Ile 2,36 9, Ser 2,21 9, Thr 2,63 10, Phe 1,83 9, Trp 2,38 9, Asn 2,02 8, Gln 2,17 9, Pro 1,99 10, Met 2,28 9, Asp 2,09 9,82 3, Glu 2,19 9,67 4, His 1,82 9,17 6, Cys 1,71 10,78 8, Tyr 2,2 9,11 10, Lys 2,18 8,95 10, Arg 2,17 9,04 12,
