Guion de practicas BCA, Ejercicios de Biología Celular

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CURSO

PRÁCTICAS DE

BIOLOGÍA CELULAR

APLICADA

Grado en Biología

Mª José Hazen (A-110) Ángeles Villanueva (A-115) José Ángel Suja (A-111) Angeles Juarranz (A-102)

CONTENIDO

Inmunofluorescencia indirecta para  - Tubulina + Contratinción del núcleo con Hoechst

• NORMATIVA DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO ................................................
• EVALUACIÓN Y DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS ....................................................
• CÉLULAS EN CULTIVO ........................................................................................................
  • Generalidades y tipos de cultivos celulares .........................................................................
  • Líneas celulares establecidas ..............................................................................................
  • Consideraciones sobre el manejo de monocapas de células en las prácticas ........................
• PRÁCTICA 1. INTRODUCCIÓN A LOS CULTIVOS CELULARES
  • Morfología general de células en cultivo ............................................................................
  • Tinción de células HeLa con azul de toluidina
  • Técnicas de microscopía de fluorescencia
  • Observación del compartimento endosomal en células vivas ............................................
  • Marcaje del compartimento endosomal con naranja de acridina ......................................
  • Objetivos de la Práctica 1 .................................................................................................
• PRÁCTICA 2. ANÁLISIS DE LOS MICROTÚBULOS .....................................................
  • Introducción a las técnicas de inmunofluorescencia ..........................................................
  • Objetivos de la Práctica
• PRÁCTICA 3. LA MEIOSIS Y EL COMPLEJO SINAPTONÉMICO ..............................
  • Introducción a la meiosis .................................................................................................
  • El complejo sinaptonémico
  • de ratón y tinción del núcleo con DAPI ............................................................................. Inmunodetección indirecta de la proteína SYCP3 en esparcidos de espermatocitos
  • Objetivos de la Práctica

EVALUACIÓN Y DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS

Las prácticas de Biología Celular Aplicada se llevarán a cabo en el Laboratorio

02.PP.LD.S21-2 , ubicado en el sótano del Edificio de Biología.

 Se establecerán cinco grupos de prácticas según el siguiente calendario:

 Grupo 1864 : 30 Octubre al 3 de Noviembre de 2017 en horario de 9 : 30 a 13 : 30

 Grupo 1814 : 30 Octubre al 3 de Noviembre de 2017 en horario de 15 : 30 a 19 : 30

 Grupo 1865 : 13 al 16 de Noviembre de 2017 en horario de 9 : 30 a 13 : 30

 Grupo 1815 : 13 al 16 de Noviembre de 2017 en horario de 15 : 30 a 19 : 30

 Grupo 1816 : 20 al 23 de noviembre de 2017 en horario de 15 : 30 a 19 : 30

La asistencia a las prácticas es obligatoria.

 Las prácticas se valorarán como un 15 % de la nota total de la asignatura. Para aprobar

las prácticas será necesario realizar un examen según las fechas establecidas por el

Decanato.

CÉLULAS EN CULTIVO

A lo largo de estas prácticas se pretende que el estudiante se familiarice con las técnicas de manipulación y observación de células en cultivo. Como veremos más adelante, el empleo de cultivos celulares necesita un equipamiento específico y ciertos procedimientos que aseguren su correcto manejo.

En este caso, no vamos a encontrar células integradas naturalmente en tejidos, como sucede en los cortes histológicos, sino que los materiales con los que trabajaremos proceden mayoritariamente de cultivos de líneas celulares establecidas in vitro. Estos preparados van a permitirnos observar una monocapa de un único tipo celular.

GENERALIDADES Y TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

El empleo de células cultivadas in vitro es una de las técnicas básicas llevadas a cabo en cualquier laboratorio de Biología Celular. Los estudios basados en cultivos celulares presentan un amplio rango de aplicaciones, que incluyen la farmacología, inmunología, genómica, ingeniería de tejidos y la toxicología entre otros.

Los estudios in vitro se engloban dentro de los denominados métodos alternativos a la experimentación animal , que intentan reducir el número de animales de laboratorio utilizados en la investigación.

Figura 1. Tipos de cultivos de tejidos. Tomado de: Freshney R.I., Culture of animal cells: a manual of basic technique, 5 th Ed., Wiley, 2005.

Los sistemas de cultivo de tejidos forman un campo de trabajo muy amplio, entendiéndose como el conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento fuera del organismo de células, tejidos u órganos durante al menos 24 horas. La Figura 1 muestra los principales tipos de cultivos de tejidos: de órganos, de explantes, organotípicos y cultivo de células disociadas.

Existe otro modo de conseguir una línea celular establecida. Se trata de que el tejido de origen tenga por si mismo capacidad de proliferación indefinida, es decir, provenga de un tejido tumoral. Este es el caso de una de las líneas celulares establecidas más empleadas en cultivos celulares, las células HeLa, originadas a partir de un tumor humano de cérvix uterino.

En cualquier caso, el trabajo con células en cultivo se facilita mediante la posibilidad de congelar el cultivo en vez de realizar un subcultivo. El procedimiento requiere también la tripsinización del cultivo, pero en este caso la suspensión celular se realiza en un medio especial que impide la formación de cristales, preservando las estructuras celulares.

LÍNEAS CELULARES ESTABLECIDAS

El empleo de líneas celulares establecidas presenta ventajas e inconvenientes. Entre las primeras se encuentra el permitirnos mantener un mayor control sobre los distintos parámetros que afectan a las células y la posibilidad de trabajar con un material muy homogéneo , dado que todas ellas son clones. Sin embargo, su uso también presenta una serie de desventajas, como son el elevado coste del material necesario para el cultivo de las células, la necesidad de mantener condiciones de asepsia y la limitación de los estudios in vitro , que no permiten hacer extrapolaciones directas sobre el comportamiento de las células y/o animales in vivo.

El desarrollo de cultivos de células in vitro requiere unas condiciones y un material específico para su desarrollo. En primer lugar, hay que tener en cuenta que este tipo de cultivos necesita llevarse a cabo en absoluta esterilidad para evitar contaminaciones en las células, ya sean de carácter inorgánico, orgánico ó biológico. Para ello se cuenta con un aparataje que permite trabajar en un ambiente estéril, como son las cabinas de flujo laminar vertical , que protegen la muestra, el ambiente y el operador.

Además, los cultivos necesitan unas condiciones ambientales muy estables para su correcto crecimiento. Dichas condiciones las proporcionan los incubadores de células, que mantienen la temperatura estable (37^0 C para células de mamíferos), un elevado grado de humedad (95%) y una concentración determinada de CO 2 (normalmente el 5%).

Los sustratos sobre los cuales crecen las células han de estar también estériles, así como las pipetas y todo el material plástico que va a entrar en contacto con ellas. Existe una amplia variedad de material desechable diseñado especialmente para el cultivo de células, que se emplea en función del protocolo experimental que se vaya a desarrollar. Normalmente, los frascos y placas de cultivo se fabrican con plásticos especiales que, además de estar estériles, presentan las características necesarias para favorecer la adhesión y crecimiento de las células.

Para mantener células in vitro , no sólo se necesitan los sustratos de crecimiento, sino que se requieren unos medios de cultivo que proporcionen todo lo necesario para el correcto crecimiento celular. Existen una gran variedad de medios comerciales, siendo sus componentes fundamentales aminoácidos, vitaminas, sales, glucosa, etc., que se suplementan con antibióticos que impiden el crecimiento de bacterias (normalmente penicilina-estreptomicina) y con suero. El suero suministra una gran variedad de sustancias que favorecen el crecimiento del cultivo, como factores de crecimiento y de adhesión, aunque se desconoce su composición exacta.

CONSIDERACIONES SOBRE EL MANEJO DE MONOCAPAS DE CÉLULAS

Las prácticas se han organizado utilizando una serie de técnicas de tinción, marcaje específico de estructuras subcelulares e inmunodetección , para la posterior observación mediante microscopía óptica. Para ello, las células han crecido sobre cubreobjetos estériles donde se llevarán a cabo todos los protocolos experimentales.

Tras el montaje sobre el portaobjetos la muestra lista para su observación final quedaría como se indica en el siguiente esquema:

Cada técnica de marcaje empleada resalta ciertas partes de la muestra, nos revela una información sobre nuestro material que es siempre parcial. Así, la combinación de distintas técnicas nos permite integrar la información obtenida para alcanzar un mayor conocimiento sobre la muestra objeto de estudio. De este modo se pretende que el alumno sea capaz, al finalizar las prácticas, de situar los conceptos teóricos de la asignatura en el contexto de la célula viva.

TINCIÓN DE CÉLULAS HeLa CON AZUL DE TOLUIDINA

o Las células HeLa se entregan crecidas en cubreobjetos y fijadas con metanol

100% a -

o C durante 6 minutos.

 Teñir con azul de toluidina 0.025% (v/v) durante 1 minuto.

 Lavar con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

 Dejar secar.

 Pasar por n-heptano para completar la deshidratación y montar en una

gota de DePex cuidando que las células entren en contacto con el

medio de montaje.

 Observar en microscopía de campo claro.

TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

En el campo de la Biología Celular, la microscopía óptica de fluorescencia es una herramienta fundamental que permite la observación de estructuras celulares tanto en células vivas como fijadas.

La microscopía óptica de fluorescencia se basa en la propiedad de ciertas sustancias, conocidas como fluorocromos, de absorber luz de una longitud de onda (λ) determinada y emitirla con un valor energético menor, es decir, con una λ mayor. Generalmente la emisión de luz se produce en el rango del espectro visible, permitiéndonos así su observación directa en el microscopio. El uso combinado de varios fluorocromos que emiten y/o absorben luz a distintas longitudes de onda permite la visualización de más de una estructura celular en una misma muestra.

En comparación con la microscopía óptica convencional, el uso de fluorocromos nos permite aumentar la definición de la imagen, dado que sólo se distinguirá la estructura deseada. Además, al resaltar únicamente las estructuras marcadas sobre un fondo negro, la cantidad de fluorocromo necesario es mucho menor que si utilizáramos un colorante en microscopía de campo claro. Este aumento de la resolución de estructuras resulta muy útil para la visualización específica de componentes celulares. Para ello se cuenta con una gran variedad de técnicas disponibles, pudiéndose encontrar, a grandes rasgos, tres tipos de fluorocromos:

Figura 4. Espectro de luz visible mostrando algunos de los fluorocromos más comunes junto con sus longitudes de onda de absorción y emisión.

 Autofluorescencia. Se basa en la capacidad de ciertos componentes celulares de fluorescer sin la necesidad de añadir ningún tipo de fluorocromo externo. Un ejemplo pueden ser los pigmentos celulares como la clorofila.

 Fluorocromos específicos. Nos referimos aquí a las propiedades de ciertas sustancias que presentan una afinidad específica para alguna estructura celular. En algunos casos, estas sustancias tienen también propiedades fluorescentes, permitiéndonos realizar detecciones específicas directamente. Pero la mayor parte de dichas sustancias nos son fluorescentes, siendo necesario conjugarlas con un fluorocromo. De este modo la sustancia aporta la especificidad y el fluorocromo nos permite visualizarla. La técnica más conocida (aunque no la única) dentro de este apartado es la inmunofluorescencia , en la cual los anticuerpos aportan su elevada especificidad.  Proteínas fluorescentes. Actualmente la tecnología nos permite alterar genéticamente a las células en cultivo para que ciertas proteínas se sinteticen combinadas a “proteínas fluorescentes” sin afectar su función. Las técnicas de transformación fluorescente están teniendo una gran proyección por su capacidad de observar procesos a lo largo del tiempo en células vivas.

Figura 6. Células Vero marcadas con naranja de acridina.

OBSERVACIÓN DEL COMPARTIMENTO ENDOSOMAL EN CÉLULAS VIVAS

El uso de colorantes vitales posibilita la observación de los orgánulos in vivo , evitando los procesos de fijación y permite el marcaje selectivo de distintos compartimentos celulares.

Como contrapartida, el tiempo de observación se encuentra muy limitado , puesto que las células no pueden hacer frente a los procesos de irradiación y desecación a los que se encuentran sometidas durante la observación.

En este caso vamos a utilizar el colorante vital naranja de acridina. Este compuesto presenta unas características físico-químicas que permiten su acumulación en los endosomas y lisosomas debido al pH ácido de los mismos.

Una vez que el compuesto entra en el compartimento endosomal se protona, impidiendo su salida al citoplasma. Así, se produce una acumulación que favorece la formación de oligómeros de naranja de acridina, los cuales presentan un efecto de metacromasia. De este modo, los lisosomas y endosomas cargados de naranja de acridina emiten luz en el rango del naranja-rojo, mientras que el resto de estructuras citoplasmáticas emiten luz verde, ofreciendo una diferenciación según el pH.

MARCAJE DEL COMPARTIMENTO ENDOSOMAL CON NARANJA DE ACRIDINA

o Las células HeLa vivas se encuentran adheridas a un cubreobjetos.

 Preparar una placa Petri con 1 ml de medio de cultivo limpio.

 Situar el cubreobjetos en el fondo de la placa (células hacia arriba).

 Añadir 10 μl de Naranja de Acridina (10-3^ M en H 2 O destilada).

 Incubar durante 8 minutos en una estufa a 37

o C.

 Realizar 2 ó 3 lavados rápidos en PBS para eliminar el exceso de

colorante.

 Montar en PBS colocando el cubreobjetos directamente sobre el

portaobjetos y observar en microscopía de fluorescencia bajo

excitación azul.

Figura 7. Esquema de un microtúbulo.

Figura 8. Esquemas de los microtúbulos en interfase y en mitosis.

El citoesqueleto es el conjunto de filamentos proteicos que forman una enorme malla de

tres dimensiones en el interior de la célula. El citoesqueleto está implicado en funciones tan

importantes como: la forma celular, resistencia mecánica, locomoción, adhesión, separación de

los cromosomas en la división celular, transporte intracelular de orgánulos, etc.

Está compuesto por: los filamentos de actina o microfilamentos, los microtúbulos y los

filamentos intermedios.

Los microtúbulos (MTs) son cilindros huecos de longitud variable y con un diámetro de

unos 25 nm. Resultan de la polimerización del heterodímero: tubulina α β, que se unen de

extremo a extremo para formar un polímero lineal llamado protofilamento. Trece

protofilamentos forman un microtúbulo.

Los MTs son estructuras dinámicas que sufren profundos cambios a lo largo del ciclo

celular. Los MTs interfásicos irradian desde un centro organizador (centrosoma) y se encargan de

múltiples funciones vitales para la célula. En cada división, los MTs interfásicos se desorganizan y

forman el huso mitótico. Por ello es sencillo identificar y cuantificar las fases del ciclo celular en la

que se encuentran las células, observando el patrón de distribución de los MTs.

PRÁCTICA 2. ANÁLISIS DE LOS MICROTÚBULOS

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

Las técnicas de inmunofluorescencia (IF) se utilizan ampliamente tanto en la investigación como en el diagnóstico clínico. Las aplicaciones incluyen la detección de determinadas proteínas en células o en tejidos. En esta técnica, los anticuerpos son químicamente conjugados con colorantes fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC) o los distintos Alexa Fluor®) lo que permite la detección de antígenos mediante técnicas de fluorescencia. Dicha fluorescencia se puede cuantificar mediante un citómetro de flujo o visualizar en microcopia de fluorescencia.

Las técnicas de inmunofluorescencia, se basan en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con sustancias fluorescentes permite detectar cantidades muy pequeñas de moléculas presentes en las células.

Las técnicas de inmunofluorescencia requieren los siguientes pasos:

 Fijación. La fijación es el primer paso de un procedimiento de IF. El objetivo es mantener las

células en un estado similar a cuando están vivas.

 Permeabilización. Los anticuerpos son incapaces de atravesar las membranas lipídicas de la

célula para alcanzar las estructuras intracelulares. Un paso de permeabilización suele ser

necesario. Suele utilizarse una permeabilización con Triton X-100 al 0.1% en PBS durante 5

minutos a temperatura ambiente.

 Bloqueo. El bloqueo es un paso importante para reducir al mínimo la unión inespecífica del

anticuerpo primario dentro de la célula.

 Inmunorreacción

Hay dos tipos de técnicas de inmunofluorescencia:

A) Inmunofluorescencia directa. Implica el uso de un único anticuerpo marcado con un

fluorocromo, acortando la duración del protocolo. Sus principales desventajas son: una señal de

marcaje más baja, un mayor coste y la menor disponibilidad en el mercado de conjugados

directos.

Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber luz de una longitud de onda (λ) determinada y

emitirla con un valor energético menor, es decir, con una λ mayor.

Figura 9. Esquema de la inmunofluorescencia directa e indirecta.

Figura 10. Resumen de los sucesivos pasos de las técnicas de inmunofluorescencia.

Figura 11. Anticuerpos utilizados. Primario (izquierda), Secundario (derecha).

 Montaje de la muestra. Después de completar el procedimiento de IF, las muestras se deben montar

sobre un portaobjetos, antes de ser visualizadas en microscopía. Para este propósito se utiliza un medio

de montaje hidrófilo (por ejemplo, Prolong) que fija la muestra al portaobjetos y que también evita su

deshidratación.

 Lavados. Entre cada paso del proceso, por lo general hay una etapa de lavado para eliminar el exceso de

reactivos no unidos. Se utiliza un sistema tampón que sea isotónico para conservar la estructura celular y

cerca del pH fisiológico. Comúnmente, PBS: tampón fosfato salino (conocido también por sus siglas

en inglés, phosphate buffered saline). Es una solución acuosa y salina que contiene cloruro sódico, fosfato

sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio. Se suelen realizar 2-3 ciclos. Es importante realizar estos

pasos rápidamente para que la muestra no se seque.

Interf se

λ exc azul λ exc UV Superposición

Interfase

Figura 12. Imágenes de células HeLa en interfase después de una inmunofluorescencia para α- tubulina (verde), contratinción con Hoechst (azul) y superposición de ambas.

Profase tardía

Metafase

Profase temprana

Anafase

Telofase

λ exc azul λ exc UV Superposición

Figura 13. Imágenes de células HeLa en distintas fases de la mitosis mediante una inmunofluorescencia indirecta para α-tubulina.

Profase tardía InteInrftaesrefase

Metafase

a (^) b c