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Guion de practicas OG, Ejercicios de Biología

Asignatura: Organizacion y Funcion de Genomas, Profesor: , Carrera: Biología, Universidad: UAM

Tipo: Ejercicios

2016/2017

Subido el 10/12/2017

georgebio
georgebio 🇪🇸

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ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DE GENOMAS
Prácticas de laboratorio
PRÁCTICA 1
Meiosis: observación de cromosomas de Ortóptero
En la presente práctica vamos a preparar y observar muestras de cromosomas de
saltamontes de la especie Arcyptera fusca.
Las células se obtendrán a partir de folículos de gónadas de saltamontes, que han sido
previamente fijadas en etanol:ácido acético (3:1).
Emplearemos la técnica de aplastado (Squashing) para elaborar las preparaciones.
Observaremos las preparaciones al microscopio óptico mediante contraste de fases.
Objetivos
-Aprender la técnica de aplastado y el empleo correcto del microscopio óptico.
-Identificar las etapas de la Meiosis.
-Distinguir entre bivalente, cromosoma y cromátida.
-Distinguir entre división Ecuacional y Reduccional.
-Determinar la morfología de los cromosomas de A. fusca.
-Determinar el número cromosómico de la especie, dado que su sistema de
determinación sexual es XX/X0.
-Identificar la posible presencia de bivalentes heterozigóticos.
Bandeado cromosómico
Existen numerosas técnicas de bandeado cromosómico (bandas C, G, R, T, etc.), el
objetivo común de todas ellas es permitir observar un patrón que identifique
inequívocamente a cada cromosoma del complemento, o bien regiones particulares de
estos.
Las aplicaciones de las técnicas de bandeado pueden ser muy variadas, aunque
generalmente se persigue obtener (y comprender) la estructura de los cromosomas y
relacionarla con su función. Las bandas también son útiles para conseguir información
indirecta a partir de la identificación de las regiones los cromosomas, permitiendo
detectar aberraciones cromosómicas (regiones que desaparecen, crecen o cambian de
sitio: deleciones, duplicaciones, inversiones o translocaciones) o relaciones filogenéticas
(por el parecido de un determinado bandeado con el de un cromosoma de otra especie,
por ejemplo).
Hay cuatro razones principales por las que los cromosomas muestran bandas cuando
son tratados:
1) Existencia de secuencias repetidas
2) Diferencias en la composición de las bases
3) Diferencias en la composición de las proteínas asociadas a los cromosomas
4) Diferencias en el grado de empaquetamiento del ADN
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ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DE GENOMAS

Prácticas de laboratorio

PRÁCTICA 1

Meiosis: observación de cromosomas de Ortóptero

En la presente práctica vamos a preparar y observar muestras de cromosomas de saltamontes de la especie Arcyptera fusca. Las células se obtendrán a partir de folículos de gónadas de saltamontes, que han sido previamente fijadas en etanol:ácido acético (3:1). Emplearemos la técnica de aplastado ( Squashing ) para elaborar las preparaciones. Observaremos las preparaciones al microscopio óptico mediante contraste de fases.

Objetivos -Aprender la técnica de aplastado y el empleo correcto del microscopio óptico. -Identificar las etapas de la Meiosis. -Distinguir entre bivalente, cromosoma y cromátida. -Distinguir entre división Ecuacional y Reduccional. -Determinar la morfología de los cromosomas de A. fusca. -Determinar el número cromosómico de la especie, dado que su sistema de determinación sexual es XX/X0. -Identificar la posible presencia de bivalentes heterozigóticos.

Bandeado cromosómico

Existen numerosas técnicas de bandeado cromosómico (bandas C, G, R, T, etc.), el objetivo común de todas ellas es permitir observar un patrón que identifique inequívocamente a cada cromosoma del complemento, o bien regiones particulares de estos. Las aplicaciones de las técnicas de bandeado pueden ser muy variadas, aunque generalmente se persigue obtener (y comprender) la estructura de los cromosomas y relacionarla con su función. Las bandas también son útiles para conseguir información indirecta a partir de la identificación de las regiones los cromosomas, permitiendo detectar aberraciones cromosómicas (regiones que desaparecen, crecen o cambian de sitio: deleciones, duplicaciones, inversiones o translocaciones) o relaciones filogenéticas (por el parecido de un determinado bandeado con el de un cromosoma de otra especie, por ejemplo). Hay cuatro razones principales por las que los cromosomas muestran bandas cuando son tratados:

  1. Existencia de secuencias repetidas
  2. Diferencias en la composición de las bases
  3. Diferencias en la composición de las proteínas asociadas a los cromosomas
  4. Diferencias en el grado de empaquetamiento del ADN

El objetivo de la presente práctica es conocer la importancia de algunas de estas técnicas que permiten obtener información en los genomas, particularmente observando la habilidad del bandeado para des-homogenizar la estructura de los cromosomas.

Objetivos -Obtener una imagen de una metafase en que se identifique la distribución de la heterocromatina constitutiva mediante Bandas C.

PROTOCOLO

Bandas C Preparar (para cada 4 estudiantes): Un coplin con Ba(OH) 2 al 5 %: Disolver 3,5 g de Ba(OH) 2 en 70 ml de H 2 0d Pasar al coplin a través de un embudo de papel de filtro Mantener en el baño, 37ºC Un coplin con H 2 0d y 5 gotas de ácido acético Un coplin de 2X SSC (20X SSC, diluido en H 2 0d), mantener en baño, 65ºC

Procedimiento: Incubar la preparación a la solución de Ba(OH) 2 al 5 %, a 37ºC durante 10 min Introducir la preparación en el coplin con H 2 0d y 5 gotas de ácido acético , lavar a RT durante 5 min Incubar la preparación en 2X SSC a 65ºC durante 30 min Aclarar la preparación con agua corriente de grifo (escurrir)

Tinción de Giemsa: Introducir la preparación 5 min (aprox) en el coplin con Tinción de Giemsa (5% en H2O) (escurrir al sacar del coplin evitando que se depositen precipitados en la superficie y secar con papel de filtro la parte inferior del portaobjetos) Observar al microscopio óptico. Localizar con objetivo de 10X en campo claro (sin cubreobjetos), y observar con 100X en campo claro (gota de agua entre portaobjetos y cubreobjetos, gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos). Excepcionalmente, si se encuentra muy teñida la preparación se puede desteñir (*) Capturar al menos una imagen de la/s metafase/s bandeadas, anotando las coordenadas del microscopio (para poder volver a localizarlas tras bandeado C) Quitar el cubreobjetos y conservar a RT.

Tinción con Fluorescencia: 4μl de medio de montaje vectashield+SYBR-Green 1:1. Alternativamente se puede utilizar DAPI en el mismo medio de montaje 1:

PREGUNTAS:

Metodología

  • Fundir la alícuota de agarosa incluida en kit.
  • Mezclar 20μl de muestra con 50μl de agarosa.
  • Poner 5μl de mezcla en un portaobjetos pretratado.
  • Colocar un cubreobjetos de 22X22.
  • Gelificar durante 5 min a 4ºC en horizontal sobre superficie fría.
  • Retirar el cubreobjetos.
  • Tratar con solución de lisis de toro 5 min.
  • Tratar con H2Od 2 min.
  • Tratar con 70% 2 min.
  • Tratar con etanol 100% 2 min.
  • Secar.
  • Teñir: 4μl mezcla medio de montaje vectashield+SYBR-Green 1:
  • Visualizar con el microscopio óptico.

PREGUNTAS:

  1. P: Describe la morfología de los espermatozoides nativos R:

  2. P: Describe la morfología de los espermatozoides con tratamiento con H2O R:

  3. P: ¿Qué frecuencia de Fragmentación observas en la muestra nativa? R:

  4. ¿Qué frecuencia de Fragmentación observas en la muestra tratada con H2O2? R:

  5. P: ¿Cómo interpretas que el tamaño del Halo de los espermatozoides fragmentados no sea igual entre espermatozoides distintos? R:

PRÁCTICA 3 :

Objetivo

Estudiar el efecto que distintas enzimas de tipo endonucleasa producen sobre el ADN.

Al finalizar la práctica el alumno deberá ser capaz de determinar la enzima que ha actuado sobre el ADN en función del efecto producido visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa.

Se trabajará con 3 enzimas nucleasas: DNAsaI Topoisomerasa I Enzima de restricción

Como substrato se emplearán 2 ADNs distintos: un plásmido circular y ADN genómico.

Metodología

  • Preparar las 6 reacciones (cada pareja preparará las 3 reacciones correspondientes a un tipo de ADN). El volumen final de cada mezcla de reacción será de 10μl.

Concentraciones originales

Mezcla de reacción

ADNs 0.5μg/μl 0.5μg Enzimas 10U/μl 10U Buffer A 10X 1X Buffer B 2X 1X Buffer C 10X 1X

  • Incubar min a 37ºC.
  • Preparar el gel de electroforesis (100ml): agarosa al 1% en TBE 0.5X con Gel Red (3μl/100ml).
  • Tras la incubación añadir 2 μl de tampón de carga y cargar las muestras en el gel.
  • Cargar el correspondiente control de cada grupo de reacciones (1 μl de ADN sin digerir + 9 μl de H 2 Od + 2 μl de tampón de carga).
  • Cargar en un pocillo libre 5 μl de marcador de tamaños (DNA ladder 1Kb).
  • Correr 1h a 100V.

Preguntas

  1. P: Describe el tipo de actividad de cada enzima. R: