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PRACTICA DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA: CUANTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS
Isabel Atencio, David Montes Estudiantes de bilogía Universidad de Sucre Facultad de Educación y Ciencias RESUMEN Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en una muestra, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en superficie. Esta técnica pretende detectar a todos los microorganismos presentes en los medios de cultivo utilizando las diluciones de muestras de microorganismos a diferentes concentraciones, por ende el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno permiten el desarrollo de los microorganismos y formación de colonias. Durante la práctica se desarrolló la dilución y conteo de las bacterias, realizando como primer paso la dilución de una muestra de suelo a diferentes concentraciones desde 10-2^ hasta 10-6^ y como un segundo paso se adicionó en una caja de Petri un 0.1 ml de las diluciones de 10-6, en otra a 10-5^ y en caja final a 10 -4. Posteriormente se observo a las 24 horas el crecimiento de microorganismo, formación de las colonias según la concentración establecida para cada uno de los medios y se procedió a cuantificar. Palabras claves: cuantificación, colonias, diluciones, microorganismos. ABSTRACT When it is required to investigate the content of viable microorganisms in a sample, the technique commonly used is the surface count. This technique aims to detect all the microorganisms present in the culture media using the dilutions of samples of microorganisms at different concentrations, thus the culture medium, the temperature conditions and the presence of oxygen allow the development of microorganisms and formation of Colonies. During the practice, the dilution and counting of the bacteria were carried out, as a first step the dilution of a soil sample at different concentrations from 10-2 to 10-6 and as a second step was added in a Petri dish 0.1 ml Of the dilutions of 10-6, in another at 10-5 and in the final box at 10-4. Subsequently, the growth of microorganism was observed at 24 hours, formation of the colonies according to the concentration established for each one of the means and was quantified Keywords: quantification, colognes, dilutions, microorganisms.
INTRODUCCIÓN
Para trabajar con un microorganismo en condiciones definidas en el laboratorio es necesario primero proceder a su aislamiento, es decir, separarlo del resto de las poblaciones con las que coexiste en la naturaleza. Para el aislamiento de organismos se utilizan medios sólidos (agar) o líquidos. Los medios sólidos de siembra (extensión o vertido) en placa, separación e inmovilización de organismos de forma individualizada en un medio nutritivo sólido, permiten que cada individuo al multiplicarse origine una colonia. Los métodos de diluciones consecutivas de la muestra pueden ser de dos tipos, los medios líquidos que solo se utilizan para aislar la especie predominante en un cultivo mixto y el método de la dilución límite, que son medios selectivos que favorecen el crecimiento de un microorganismo específico. Estos se emplean cuando el organismo que quiere aislarse se encuentra en forma minoritaria. (1) El objetivo de la práctica fue conocer el fundamento de las técnicas más utilizadas para el recuento microbiano y establecer cuantificación de microorganismos a partir de una muestra, mediante el método de recuento en superficie.
METODOLOGIA.
Preparación de una serie de diluciones y siembra en superficie. Se marcaron los tubos con diluyentes (desde 10-1^ hasta 10-6) y las placas de Petri con el medio SPC por duplicado (desde 10-4^ hasta 10-6). Se tomó 1 mL de muestra de suero y se transfirió a un tubo con 9 mL de agua peptonada esterilizada, luego se agitó el tubo entre las manos. Esta correspondió a la dilución 10-1. En condiciones asépticas, se pipeteo 1 mL de la primera dilución 10-1^ al tubo marcado con 10-2. Se repitió el procedimiento anterior con pipetas distintas hasta la dilución 10-6. Para la siembra en superficie, se vertió alícuotas de 0.1 mL sobre las placas en orden inverso, es decir desde 10-6^ hasta 10-4. Se distribuyó el inóculo en toda la superficie de la caja con la ayuda de un asa de Drigalsky, que previamente se sumergió en alcohol, se flameó con el mechero y se dejó enfriar. Se deja en reposo durante 10 minutos. Se incubo las cajas en forma invertida a 37°C durante 24 horas y se realizó la cuenta de colonias.
Después de haber realizado las diluciones, sembrar y esperar un tiempo de 24 horas de incubación a 37° C, se observó crecimiento bacteriano en todas la diluciones sin embargo estas no cumple con la disminución en base 10, además el mayor crecimiento corresponde al factor de dilución 10 -4^ fue de 37 colonias contadas cómo se observa en la figura 1.
Es por esto que se halla en esa dilución las unidades formadoras de colonias de la siguiente manera: UFC: # de colonias * reciproco del factor de dilución * vol. de muestra sembrada UFC= 35 * 10^4
UFC= 10* 10^5
UFC= 3 * 10^6
Para la cuantificación de microorganismo en esta práctica se llevó a cabo el método de diluciones seriadas que consiste en la disminución de la concentración de una sustancia en una solución para esto se debe tener en cuenta un factor de dilución, el cual es el número de veces que disminuye la concentración de la sustancia original en un paso de dilución, como se puede observar anteriormente los
resultados no siguen esa disminución en base 10, a pesar que este método tiene características muy importantes, como que es muy utiliza en serología para la realización de diversas pruebas clínicas y de investigación, ésta permite obtener resultados semi- cuantitativos, así mismo esta técnica presenta falencias ya que el porcentaje de incertidumbre aumenta debido a que requiere mayor número de pasos, puesto que si se comete un error al principio del procedimiento este altera todos los demás resultados(2). A pesar de todos los resultados obtenidos permiten cumplir con los objetivos de esta práctica, pues de una u otra manera se observó crecimiento en el agar standard plate count el cual fue utilizado como medio de cultivo debido a que este es el más recomendado para el recuento de microorganismos o bacterias aerobias que se encuentran en agua residuales, alimentos o suelo, ya que presenta un alto nivel nutricional gracias a sus componentes, este agar contiene: Triptona que presenta alto contenido en triptófano, el cual es el sustrato utilizado por los microorganismos para la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. Dextrosa: forma cristalizada de la glucosa, es el valor energético básico requerido por todos los animales.
3* 10^6 = 300.000.000 ufc/ gr
10* 10^5 = 100.000.000 ufc/ gr
35* 10^4 = 35.000.000 ufc/ gr
Extracto de levadura: la cual es otra fuente de nutrientes debido que es rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento (4). Finalmente es evidente que la dilución debe permitir generar colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad viable), la cual se contará como una bacteria a pesar de esto las diluciones seriadas requieren de cuidado y pulcritud ya que presenta un alto porcentaje de error si no se realiza de manera adecuada (2). CONCLUSIONES
Este método no solo puede ser
usado para el conteo de poblaciones microbianas, sino también para el aislamiento de organismos Los medios de cultivo son importantes para que las poblaciones de bacterias puedan crecer y desarrollarse en colonias visibles, lo cual permite la cuantificación de la población de microorganismos en este caso de bacterias. CUESTIONARIO
1. Investigue qué técnicas existen para el conteo total de
microorganismos, cuál es su fundamento? Banco de diluciones. Técnica que consiste en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas. Tras incubar se podrán obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitirá conocer el número de células existentes en el cultivo original. Contaje directo en cámara de recuentos Se basa en el recuento directo del número de célula s en un volumen determinado, prefijado en la cámara de recuento, mediante su observación al microscopio. El método no permite distinguir entre células viables y no viables. Medición de la densidad óptica en el espectrofotómetro Se trata del método más habitual para el seguimiento del crecimiento de un cultivo bacteriano. La medición de alícuotas o muestras del cultivo a lo largo del tiempo, permite desarrollar curvas de crecimiento de la población bacteriana. Ello permitirá, a su vez, la comparación de tasas de crecimiento en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones óptimas, etc.
de bacterias, hongos y levaduras y cuál es su fundamento? SISTEMAS BASADOS EN IMPEDANCIA: BACTRAC Mide los cambios que producen los microorganismos de un cultivo que alteran los substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la impedancia. Recuento total Enterobacterias E.coli/ Coliformes Hongos y levaduras Hongos y levaduras S. Aureus
SISTEMAS BASADOS EN
CITOMETRIA DE FLUJO: AES:
Bactiflow Marcaje de las células, detección una a una y contaje Enterobacterias Hongos y levaduras Salmonella
SISTEMA SimPlate: Biocontrol Placa de plástico circular de 84 pocillos. Lectura por fluorescencia. El número de positivos se convierten en Valores NMP (7) Recuento total Coliformes/E.coli Mohos y levaduras Campylobacter.
BIBLIOGRAFÍA
1- Brooks, G.F., Jawetz, E., Butel, J.S., Melnick, JL, Orston, L.N. y Adelberg, E.A. (1991). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Manual Moderno. 14a Ed. México. 2- Alef K. 1995. Soil respiration. In: Methods in applied soil microbiology and biochemistry. K. Alef and P. Nannipieri (Eds). AcademicPress. 3- Murray P.R., Baron, Pfaller, Tenover and Yolken. 1999. Manual of clinical microbiology,
7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
4- MacFaddin. 2000. Biochemical tests for identification of medicalbacteria, 3rd ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
5- P. López Carmen E., técnicas de recuento bacteriano, microbiología facultad en ciencias básicas e ingeniería,http://www.unad.edu .co/fac_ingenieria/pages/Micro biologia_mutimedia/ 3_4_3recuento.htm#tecrecuent o, consultado miércoles 5 de octubre de 2016.
6- Sasson, Albert, Las biotecnologías: desafíos y promesas Investigaciones Biológicas, LaHabana.1984,http://www.ec ured.cu/index.php/Cultivos_pur os, consultado miércoles 5 de octubre de 2016.
7- BIOMÉRIEUX Industry. 2011. Métodos Rápidos para el control Microbiológico de Alimentos. Disponible en: http://www.plancalidadproducto spesqueros.es/uploads/ponenc ias3/controlmicrobiologico.pdf. Consultado miércoles 5 de octubre de 2016.
