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Asignatura: Bioquímica, Profesor: Mercé Pamblanco, Carrera: Biologia, Universidad: UV
Tipo: Ejercicios
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Grupo AL
P.1. Disoluciones tampón. Punto isoeléctrico de las proteínas; P.2. Técnicas de separación de proteínas: cromatografía y electroforesis; P.3. Actividad enzimática fosfatasa alcalina; P.4. Obtención y análisis electroforética de DNA.
BIOLOGÍA
El control del pH es esencial para mantener la estructura y funcionalidad de las células. También es importante en experimentos, el mantenimiento del pH de las disoluciones en las que tienen lugar las reacciones y procesos bioquímicos. Hay sistemas que resisten a los cambios de pH después de la adición o la eliminación de protones, llamadas disoluciones amortiguadoras del pH (son ácidos débiles, AH protonada, que se encuentran en la disolución en equilibrio con su base conjugada, A¯ desprotonada).
Los OH¯ añadidos reaccionan con AH y forman su base; mientras que los H⁺ añadidos reaccionan con la forma disociada para formar el ácido.
Gran parte de los H⁺ son consumidos, por tanto no contribuyen al pH y este no baja. La adición de una base consume H⁺ pero son repuestos por la disociación del ácido y así el pH no sube (pH = ± pKₐ)
Las propiedades ácido-base de las proteínas son atribuibles a grupos ionizables terminales de la cadena polipeptídica, α-NH₃ y α-COO¯, y a los presentes en la cadena lateral de cada aminoácido. La composición de cada aminoácido determina el tipo y número de grupos ionizables de una proteína.
El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el valor de pH en el que su carga neta es 0 (cargas negativas - = cargas positivas +). Cuando pH ˂ pI, predominan las cargas positivas (+); y cuando pH ˃ pI, predominan las cargas negativas (-).
Las proteínas tienen solubilidad mínima cuando el pH de medio es igual al pI de la proteína (pH = pI). Esto se utiliza para aislar y purificar proteínas (precipitación isoeléctrica).
BIOLOGÍA
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS EN FUNCIÓN DE LA DENSIDAD DE CARGA
La movilidad electroforética es la migración por unidad de campo eléctrico dependiendo del tamaño, forma y carga de la molécula (y de la viscosidad del medio).
Se realiza en un soporte que puede ser de papel, acetato de celulosa, agarosa o acrilamida.
El acetato de celulosa es un soporte no restrictivo (debido al gran tamaño de sus poros) donde la movilidad depende de la densidad de carga de la molécula.
Para visualizar las bandas de proteínas se tiñe con NEGRO AMIDO.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS EN FUNCIÓN DE LA MASA MOLECULAR: SDS-PAGE
En el gel de poliacrilamida en presencia de SDS-PAGE, las proteínas desnaturalizadas con SDS se someten a un campo eléctrico y son transportadas a través de un soporte restrictivo (poros pequeños que dificultan el movimiento).
El SDS iguala la densidad de carga de todas las proteínas, estas se separan en función de la masa molecular por el efecto tamiz de la poliacrilamida.
Para determinar la masa molecular de las proteínas, se representa en una gráfica el logaritmo de la Mr de las proteínas patrón frente a la distancia recorrida por el gel, y se interpreta la distancia de las proteínas problema.
BIOLOGÍA
Los enzimas son catalizadores específicos y potentes que hacen posible la coexistencia de un elevado número de reacciones químicas dentro de la célula. El mecanismo de cinética enzimática más simple es el representado por la ecuación de Michaelis- Menten, que explica el fenómeno de saturación.
Las fosfatasas-alcalinas (PA) son enzimas ampliamente distribuidos en organismos procariotas y eucariotas, responsables de eliminar grupos fosfato de una variedad de moléculas como los nucleótidos, proteínas y alcaloides.
Procedimiento:
A partir del valor de la pendiente de Δ A₄₀₀/min para cada una de las concentraciones de sustrato, se calculan las v₀ utilizando la ecuación de Lambert-Beer:
BIOLOGÍA
ELECTROFORESIS DE DNA EN GEL DE AGAROSA
Los geles de agarosa se utilizan como soportes restrictivos debido a su elevada porosidad.
Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel de agarosa, el DNA (cargado negativamente en pH neutro) se desplaza hacia el ánodo a una velocidad que depende de:
Finalizada la electroforesis, el gel se coloca en un transiluminador de luz ultravioleta (UV), con la finalidad de observar la fluorescencia debida a la intercalación del BROMURO DE ETIDIO entre las bases nitrogenadas del DNA.
