Cuaderno prácticas de laboratorio, Resúmenes de Bioquímica

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UNIVERSITAT DE VALÈNCIA

DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR

GRADO EN QUÍMICAS

PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA

Curso 2024-

ÍNDICE

Instrucciones 1 Consideraciones generales 2 Guión de prácticas Práctica 1: Representación y análisis de estructuras de macromoléculas 3 Práctica 2: Actividad enzimática fosfatasa alcalina 4 Práctica 3: Obtención de DNA y análisis de un plásmido con enzimas de restricción 8 Práctica 4: Metabolismo de hidratos de carbono 14

INSTRUCCIONES

Documentos de apoyo

En Aula Virtual (Asignatura: Bioquímica. Sección: Prácticas ) encontraréis una copia de este mismo documento

( Cuaderno de laboratorio ) así como información actualizada sobre las prácticas

El cuaderno de prácticas contiene una introducción para cada práctica, un guion detallado (protocolo) sobre su

desarrollo y algunas preguntas que serán resueltas y comentadas con el profesor/a durante la sesión que

corresponda a esa práctica. Debéis leer el texto de cada práctica antes de la sesión que corresponda. También debéis

llevar impreso este documento a cada sesión de prácticas.

Para la evaluación continuada de las prácticas dispondréis de cuestionarios previos y formularios de resultados , que

estarán disponibles en Aula Virtual la semana que corresponda a cada práctica.

Desarrollo de las prácticas

Cada semana, en Jueves o Viernes (dependiendo de tu grupo de prácticas) trabajaremos una práctica concreta. Para su aprendizaje y evaluación debes proceder como sigue:

Días anteriores a la práctica

Lee con atención la introducción y el protocolo de la práctica que toca esa semana. Durante el Miércoles de la semana deberás responder algunas preguntas relacionadas con la práctica, a través de un cuestionario (test) previo específico que encontrarás en Aula Virtual.

Sesión de cada práctica

La asistencia a las prácticas es obligatoria y evaluable.

Completa la práctica y toma nota de tus resultados, ya sean numéricos o cualitativos, así como de conclusiones o valoraciones de interés que se discutan en el laboratorio. Responde a las preguntas que aparecen en el cuaderno sobre la práctica.

Días posteriores a cada práctica (máximo 4 días siguientes)

Para cada práctica encontrarás en Aula Virtual una Tarea a través de la cual podrás descargar el formulario de resultados así como entregarlo cuando lo hayas completado.

Completa individualmente el formulario de resultados de la práctica. Exporta dicho documento a formato pdf. Comprueba que el documento es legible , que aparece claramente escrito tu nombre, el de tu pareja en esa práctica y el de tu profesor/a de esa práctica. Asegúrate de que has introducido correctamente la información necesaria para responder a cada pregunta.

Entrega tu formulario de manera individual a través de la Tarea correspondiente de Aula Virtual. Comprueba que la entrega se llevó a cabo correctamente. Ten en cuenta que habrá una fecha y hora límite, y que no se admitirán entregas retrasadas ni por ningún otro medio.

6. Unir los puntos con una recta o curva continua.

En este manual se utilizan las unidades de magnitud y las normas recomendadas por el Sistema Internacional (SI). Es conveniente recordar que los símbolos de las unidades del SI deben de escribirse en minúsculas (excepto si derivan de un nombre propio), si bien excepcionalmente en el caso del litro se admite "L" para evitar confusiones con el símbolo unidad "l". Los símbolos se escriben igual en singular que en plural (7 mol es correcto, 7 moles es incorrecto). Cuando se trata de unidades compuestas, formadas por la multiplicación de dos o más unidades, pueden escribirse con o sin punto entre ellas. De igual modo, si se dividen dos o más unidades, también son correctas las formas mol/L o molL -1^ o mol×L -1. Además, con la finalidad de no emplear números demasiado pequeños, se admite el uso de submúltiplos de las unidades, lo que se indica mediante un prefijo unido al símbolo de la unidad a la que modifican. Los prefijos más empleados en bioquímica son: pico (p, 10 -12), nano (n, 10 -9), micro (μ, 10 -6) y mili (m, 10 -3).

PRÁCTICA 1

REPRESENTACION Y ANÁLISIS DE ESTRUCTURAS DE MACROMOLÉCULAS

La información correspondiente a esta práctica se encuentra en el siguiente link :

https://www.uv.es/bbm/bqq

Las fosfatasas alcalinas ( PA ) son enzimas (ortofosfórico-monoéster-hidrolasas), ampliamente distribuidas en organismos, tanto procariotas como eucariotas, responsables de eliminar grupos fosfato de una variedad de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. En tejidos animales se localizan en la membrana de las células, siendo particularmente abundantes en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. El aumento o disminución de PAs en el plasma sanguíneo (fase acuosa de la sangre) tiene significado clínico ya que orienta sobre la presencia de distintos tipos de enfermedades.

La PA de Escherichia coli ( E. coli ) es una metaloenzima dimérica (Mr del monómero 94.000) con dos átomos de Zn y uno de Mg por monómero. Se ha determinado la estructura tridimensional de esta enzima y se sabe que el residuo de Ser que se fosforila reversiblemente y transitoriamente durante la catálisis se localiza cerca de los sitios de unión de los metales, en un bolsillo donde también puede unirse el anión fosfato de manera que éste puede actuar como inhibidor de la reacción (ver estructura 1ED8 en el Protein Data Bank ). La enzima activa se localiza en el espacio periplásmico y cataliza la hidrólisis inespecífica de ésteres del ácido fosfórico, sustancias que normalmente son incapaces de atravesar la membrana plasmática. La síntesis de la enzima aumenta cuando las células crecen en medios deficientes en fosfato, lo que explica su papel en el suministro de fosfato inorgánico a la bacteria.

La acción de la fosfatasa alcalina sobre un sustrato artificial incoloro como el fosfato de p -nitrofenilo origina fosfato inorgánico (P (^) i ) y un producto de color amarillo que absorbe luz visible de 400 nm, con un coeficiente de extinción molar (ε) de 1,7·10 4 M-1^ cm-1. Aprovechando las características cromogénicas del producto de la reacción, utilizaremos colorimetría (espectrofotometría con luz visible) para llevar a cabo un análisis cinético de la enzima.

El objetivo de la práctica es estudiar la reacción catalizada por la fosfatasa alcalina de E. coli en ausencia y en presencia de fosfato inorgánico, el cual actúa como inhibidor de la enzima. Para ello mediremos velocidades iniciales de la reacción catalizada por la enzima a distintas concentraciones de sustrato y a través de representaciones gráfica de dobles inversos ( Lineweaver-Burk ) determinaremos los parámetros cinéticos de la reacción: constante de Michaelis-Menten (K (^) m ) y V (^) màx ). La comparación de dichos parámetros para los casos en ausencia y presencia de fosfato permitirá determinar el tipo de inhibición. Así mismo utilizando los parámetros cinéticos calcularemos el valor de la constante de disociación del complejo Enzima-Inhibidor (K (^) i ).

Protocolo experimental

1. Materiales y reactivos - Colorímetro - Cubetas de plástico de 1 mL (10 por pareja) - Pipetas Pasteur de plástico - Pipetas automáticas: P200 y P - Tampón del medio de reacción: Glicina 0,2 M pH 10,4 con Zn 2+^ y Mg^ 2+^ 2 mM (12 mL por pareja) - Sustrato (0,2 mM): p-nitrofenil fosfato (pNPP, Sigma-Aldrich) conservado a -20 ºC. Se pesa y disuelve en agua la cantidad adecuada poco antes de utilizarlo y se distribuye a los estudiantes (5 mL por pareja). - Inhibidor: Fosfato sódico 3 mM (0,45 mL por pareja) - Enzima fosfatasa alcalina de E. coli (Sigma P 4252, 100 U, 0,5 U/μL). La enzima comercial se encuentra en forma de suspensión precipitada con alta concentración de sulfato amónico. Se diluye 1/1000 en agua y se distribuye entre los estudiantes (2 mL por pareja). 2. Procedimiento

Para los análisis cinéticos en ausencia y en presencia del inhibidor se procederá preparando directamente en las cubetas las mezclas de reacción añadiendo, en el orden que se indica a las Tablas 1 y 2 (ver mas abajo), las cantidades (mL) de los componentes de la mezcla.

Las cinéticas se realizarán por separado en cada una de las mezclas de reacción, empezando por la mezcla 1, de la manera siguiente:

i. Una vez añadido el sustrato a cada muestra, en la cantidad que corresponda, se mezcla ésta con ayuda de una pipeta Pasteur ii. Se coloca la cubeta en el colorímetro para ajustar a 0 el valor de A 400. iii. Se saca la cubeta y se añade la enzima (tiempo 0). Se mezcla bien y se coloca de nuevo en el colorímetro, tomando nota a continuación de los valores de A 400 a tiempos de 20 s, 40 s, 60 s, 80 100 y120 s, a partir del momento de adición de la enzima. Los valores de A 400 se anotarán en una tabla junto a los tiempos correspondientes ( Figura 2A ).

Nótese que en cada cubeta variamos la concentración del sustrato sin que varíe la cantidad de la enzima. La velocidad “inicial” de la reacción en cada cubeta, en unidades de ∆A 400 /s, se obtendrá de la pendiente de la recta, ajustada sobre valores de A 400 a distintos tiempos ( Figura 2B ). Dichos valores de v 0 pueden expresarse en unidades de concentración molar por unidad de tiempo utilizando la ecuación de Lambert- Beer y el coeficiente de extinción del producto de la reacción, mencionado en la introducción (ε 400 = 1,7·10 4 M-1^ cm-1).

Figura 2. A) Tabla de datos de absorbancias, medidas para cada muestra a distintos tiempos desde la adición de la enzima. B) Determinación de velocidades iniciales correspondientes a cada concentración de sustrato, a partir de la pendiente de representaciones de A 400 frente al tiempo. C) Representación directa de v 0 frente a [S] y ecuación de Michaelis-Menten. D) Representación lineal de dobles inversos ( Lineweaver-Burk ) y ecuación de la recta utilizadas para obtener los parámetros cinéticos ( Vmax , a partir del valor de la ordenada en el origen, y K (^) M , a partir de la pendiente de la recta). Las representaciones gráficas y su análisis (ajuste de las rectas y determinación de los parámetros correspondientes) debe llevarse a cabo con ayuda de una hoja de cálculo.

CUESTIONES. PRÁCTICA 2

1. Explica para qué se utilizan los siguientes reactivos, instrumentos y/o parámetros: (a) Colorímetro (b) Tampón (c) Fosfato de p -nitrofenilo (d) Coeficiente de extinción molar

2. Contesta verdadero o falso, y razona brevemente la respuesta: “La pendiente de la gráfica en la que se representa la velocidad inicial de la reacción (v (^) o, M/s ) en función de la concentración del sustrato (M) nos permite determinar la constante de Michaelis.” 3. Considera la reacción A → B catalizada por una enzima, donde A es un sustrato de color amarillo con una absorción máxima a 420 nm y B es un producto de color verde con un máximo de absorción a 560 mm. (a) Propón dos estrategias diferentes para determinar la velocidad de la reacción enzimática utilizando medidas espectrofotométricas. (b) ¿Qué harías para expresar la velocidad inicial de la reacción en moles de B formados x L -1^ x min -1? 4. Con el objeto de determinar la velocidad inicial de una reacción enzimática S → P se ha medido la variación de la absorbancia a 530 nm (máximo de absorbancia de S) en función del tiempo, obteniéndose los resultados que se muestran en la siguiente tabla. Utilizando dichos datos y sabiendo que el ε^530 del sustrato de la reacción es 10.000 M-1^ cm-1, lleva a cabo la representación gráfica que corresponda y determina la velocidad inicial de la reacción.

t (min) A 530 1 1, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0,

NOTAS

mapa de restricción del plásmido, donde se indican los enzimas de restricción con corte único (negrita) o

corte simple (normal). Se indican además los lugares de corte con números que corresponden a la distancia (en pares de bases) desde un punto de referencia en la parte superior (flecha roja) hasta el sitio de corte.

Una vez digerido el plásmido con una o varias enzimas de restricción, elegidas dependiendo de los fragmentos que se desee obtener, el resultado de la digestión se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polímero lineal que se extrae de algas y que está constituido por la unidad disacárida básica: D-galactosa-3,6-anhidro-L-galactosa. Los geles de agarosa se utilizan como soportes restrictivos de electroforesis debido a su elevada porosidad. Para llevar a cabo la electroforesis, las muestras de DNA se cargan en pocillos grabados en el gel de agarosa y éste se sumerge en una solución acuosa tamponada donde también se encuentran los electrodos de una fuente de alimentación (en posiciones cercanas a extremos opuestos del gel). Dado que el DNA se encuentra cargado negativamente a pH neutro, cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, las fibras de DNA serán atraídas hacia el ánodo (polo positivo). Puesto que la densidad de carga eléctrica en el DNA (relación q/m) es constante con independencia de su tamaño y secuencia, la velocidad del desplazamiento dependerá de los parámetros que afectan a su movimiento a través de los poros del gel. Estos parámetros son:

• Características físicas de las moléculas de DNA, principalmente su tamaño (número de pares de bases) y su nivel de compactación, que viene dado por su conformación, es decir, si se encuentra superenrollado, circular relajado, o lineal.
• Características del medio y condiciones de separación, especialmente la concentración de la agarosa, de la cual dependerá el tamaño de los poros del gel, la composición del tampón (fuerza iónica, pH…) y el valor del voltaje aplicado.

Si se separan en un mismo gel, bajo unas mismas condiciones, mezclas que contienen moléculas de DNA de distinto tamaño y/o distinta conformación, dichas moléculas presentarán distinta migración electroforética y podrán distinguirse después de la separación. Para una misma conformación, la migración es mayor cuanto menor es el tamaño de las moléculas, y la utilización de muestras con DNA de tamaños conocidos (marcadores) permite determinar, con buena aproximación, la longitud de moléculas de tamaño desconocido. Por otro lado, para un mismo tamaño la migración es mayor cuanto mayor es el nivel de compactación de las moléculas. Por ejemplo, la migración de un plásmido circular superenrollado es mayor que la del mismo plásmido en estado lineal (por corte en un punto). A su vez, este último migrará más que el mismo plásmido en estado circular relajado.

Por otro lado es necesario tener en cuenta que para observar el resultado de una separación electroforética es necesario utilizar algún tipo de marcaje o teñido específico para las moléculas de DNA. Generalmente se utiliza bromuro de etidio, una molécula hidrofóbica formada por varios anillos aromáticos de estructura plana que en disolución acuosa interacciona de manera extensiva con las bases del DNA, intercalándose entre ellas. Dado que el bromuro de etidio es fluorescente, y puesto que el rendimiento cuántico de fluorescencia aumenta en entornos apolares, la asociación de esta molécula con el DNA permite que al irradiar los geles de electroforesis con luz ultravioleta las posiciones en las que se encuentra dicho DNA aparezcan como bandas de un brillo fluorescente intenso.

Atención: Por la misma razón que el bromuro de etidio es útil para nuestro análisis, su tendencia a unirse al DNA, incluido el de nuestras células, lo convierte en un agente elevadamente cancerígeno. Tenlo presente durante la práctica. Extrema la precaución y trabaja con guantes cuando manipules geles de electroforesis impregnados con bromuro de etidio.

El objetivo de la práctica es llevar a cabo un análisis por corte con enzimas de restricción de un DNA

plasmídico de Escherichia coli mediante electroforesis en geles de agarosa. En el análisis del plásmido, se

observará la migración electroforética de su conformación nativa, para apreciar la diferencia entre el DNA

superenrollado y otros posibles estados del plásmido, y se estimará el tamaño de los fragmentos de DNA

obtenidos por digestión con los enzimas de restricción. Un segundo objetivo es la obtención y visualización

de fibras de DNA de timo de ternera.

Protocolo experimental

1. Materiales y reactivos - Vórtex - Microondas - Timo de ternera - Erlenmeyer de 250 mL - Homogenizador Osterizer - Varillas de vidrio - Centrífuga de mesa - Tuboscorning de 50 mL para centrífuga - Agitador magnético - Agitador de tubos - Termobloc - Pipetas de vidrio (1, 2, 5 y 10 mL) - Tubos eppendorf - Microcentrífuga - Erlenmeyer 100 mL y tapón - Pipeta automática de 200 y 20 μL y puntas - Etanol 96% frio (-20 °C) - Cloroformo: alcohol isoamílico (3:1) - NaCl 10% (p/v) - SDS 10% (p/v) en etanol 50% (v/v) - Agarosa (Tipo I, A-6013, Sigma) - Plásmido pBR322 nativo - Enzimas de restricción EcoRI, PstI, HincII y los tampones para restricción correspondientes - Cubeta y accesorios de electroforesis de DNA y fuente de alimentación de corriente continua - Tampón de homogenización: Tris-HCl 0,01 M pH 7,5. - Tampón de electroforesis de DNA: 0,5X TBE (TBE: 45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA. Para 1 L de 5X TBE pH 8,3: 54 g Tris + 27,5 g ácido bórico + 20 mL 0,5 M EDTA).

• Patrones de tamaños para electroforesis de DNA: DNA del fago λ digerido con HindIII yGeneRuler

1kb plus DNA ladder que contiene una mezcla de DNAs de diferentes tamaños

• Disolvente de muestras de DNA (10X): 0,25% (p/v) azul de bromofenol, 0,25% (p/v) xileno- cianol y 60 % (v/v) glicerol en tampón Tris-HCl 60 mM, EDTA 6 mM, pH 7,5. 2. Procedimiento

2.1. Análisis del plásm ido

2.1.a Digestión con enzimas de restricción de DNA plasmídico

Cada grupo de dos parejas (cada lado de la bancada) hará una misma restricción del plásmido comercial pBR322 como se indica:

Cada pareja dispone de un eppendorf con el plásmido a digerir, en el que se indica qué enzima se va a usar. Dispone también de agua, enzima o enzimas a usar y tampón de corte 10x específico para esas enzimas.

Atención: dado que se van a pipetear volúmenes muy pequeños, hay que escoger la pipeta adecuada y pipetear correctamente (seguir instrucciones de la profesora/profesor)

Los volúmenes que se deben pipetear se indican a continuación para cada caso:

Restricción pBR322 con EcoRI:

• 10 μL DNA para EcoRI
• 6 μL H 2 O
• 2 μL Bf EcoRI 10x
• 2 μL EcoRI

Restricción pBR322 con PstI:

• 10 μL DNA para PstI
• 6 μL H 2 O
• 2 μL Bf PstI 10x
• 2 μL PstI

Preparación de un gel de agarosa

2.2. Obtención del DN A crom osóm ico de tim o de ternera

En un primer paso se procederá a romper las estructuras celulares. Seguidamente se disocian los complejos nucleoproteicos utilizando un detergente y disolventes orgánicos. Por último, se purificará el DNA por precipitación. Todo ello se lleva a cabo como sigue:

Se homogeneizan 12 g de timo de ternera troceado con 150 mL de tampón Tris 0.01 M, pH 7.5, en un homogeneizador Osterizer (5-10 min en la posición BLEND del aparato, o bien, al nº 1 durante 5 minutos). Se transvasa a un erlenmeyer de 250 mL y se agita durante 5 min. Se añaden 17 mL de SDS al 10% (p/v) en etanol al 50% (v/v) con el objeto de conseguir una concentración final en SDS del 1% (p/v).

Se agita con suavidad durante 5-10 min. A cada uno de los grupos se le dan 10 mL de esta mezcla con el objeto de continuar la extracción. A cada alícuota de 10 mL se le añade, en un erlenmeyer de 100 mL, 1 volumen (10 mL) de cloroformo:alcohol isoamílico (3:1, v/v). Una vez bien tapado el erlenmeyer se agita con la mano enérgicamente, durante 10-15 min hasta obtener una mezcla homogénea.

Se centrifuga en un tubo corning con tapa a 4000 rpm durante 10 min. La fase acuosa superior,

opalescente, se traspasa a un erlenmeyer de 100 mL. Se añaden 20 mL de NaCl 10% (p/v) y se mezcla. Se añade 1 volumen (unos 25 mL) de etanol frío. Se observará la aparición de un precipitado que contiene las fibras de DNA, las cuales se extraen de la disolución siendo enrolladas sobre una varilla de vidrio.

NOTAS

PRÁCTICA 4

METABOLISMO DE HIDRATOS DE CARBONO

La glicolisis es una ruta metabólica que transforma la glucosa y otros monosacáridos de seis carbonos en dos moléculas de tres carbonos (piruvato) mediante una secuencia de diez reacciones enzimáticas. Este proceso genera energía (ATP) y poder reductor (NADH). Los organismos aerobios utilizan la glicolisis como la primera etapa de la degradación completa de los hidratos de carbono hasta CO2 y agua, obteniendo más ATP y reoxidando el NADH mediante la respiración. Los anaerobios, microorganismos que viven en ausencia de oxígeno, pueden obtener todo el ATP que necesitan mediante la glicolisis. Estos organismos utilizan dos rutas principales para oxidar los equivalentes de reducción (NADH) formados en la glicolisis y suministrar los NAD +^ necesarios para que el proceso glicolítico continúe, dando lugar a las fermentaciones. En las fermentaciones no hay cambio neto del estado de oxidación de los sustratos (glucosa) al transformarse en productos (etanol + CO2, o lactato). La fermentación alcohólica es característica de las células de la levadura ( Saccharomyces cerevisiae ). Consiste en una primera etapa [1] de descarboxilación del piruvato, producto de la glicolisis, catalizada por la piruvato descarboxilasa, en la que se producen CO2 y acetaldehído. En una segunda etapa [2], catalizada por la alcohol deshidrogenasa, el acetaldehído se reduce a etanol.

CH3-CO-COO-^ →CO2 + CH3-COH [1] CH3-COH + NADH + H+^ →CH3-CH2OH + NAD +^ [2]

La levadura usada en panadería realiza esta fermentación: el CO2 que se produce es el responsable de que la masa de pan suba, y el alcohol que se forma, se evapora durante la cocción. Es también este tipo de fermentación el que produce el etanol de las bebidas alcohólicas.

Los animales disponen de una reserva de energía en forma de glúcidos que es el glucógeno, un polímero lineal de residuos de glucosa unidos por enlaces glicosídicos (α-1,4) y que presenta ramificaciones (α-1,6) cada 10 residuos de glucosa. Casi todo el glucógeno se localiza en hígado y en músculo esquelético. En un animal bien alimentado, la glucosa se transforma en glucógeno en el hígado y en el músculo (glucogenogénesis). En ayuno, el glucógeno hepático se moviliza, se degrada (glucogenolisis), para suministrar glucosa al organismo, agotándose casi toda la reserva de este combustible al cabo de 24-48 h. A partir de este momento, tiene una gran importancia el proceso de gluconeogénesis, que utilizando sustratos no glucídicos (lactato de músculo esquelético, glicerol de los triacilgliceroles, algunos aminoácidos de las proteínas, etc.) genera la glucosa que requiere todo el organismo, especialmente el cerebro. El glucógeno del músculo esquelético no se ve particularmente afectado por el ayuno, de forma que, en ausencia de ejercicio violento, su nivel es relativamente constante. Además, este glucógeno, a diferencia del hepático, no cede glucosa a la circulación sanguínea porque el tejido muscular no dispone de la actividad enzimática glucosa-6-fosfatasa (ver la figura).

El objetivo es estudiar la degradación de azúcares en condiciones anaerobias (fermentación alcohólica de la glucosa) y determinar el contenido de glucógeno en tejidos animales.