¡Descarga practiques 2006 y más Ejercicios en PDF de Inmunología solo en Docsity!
PRÀCTIQUES D’IMMUNOLOGIA (LLICENCIATURA BIOLOGIA).
Curs 2005-
Calendari DIA 1 Immunitat cel·lularImmunitat humoral
DIA 2 Immunitat humoral
DIA 3 Immunitat cel·lularImmunitat humoral
DIA 4 Immunohistologia
Separació limfòcits
ELISA (1)^
ELISA (2)^
Òrgans limfoides
PCR (obtencióDNA genòmic)
Immunodifusióradial simple (IRS)
PCR (electroforesi)i lectura IRS
Precipitació Igs+diàlisi
PCR (2)^
Citometria flux^
Discussió generalpràctiques
Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia MP Armengol
Immunologia Diagnòstica-Recerca^ Autoimmunitat
Immunoquímica
Immunoal·lèrgia
Immunologia Cel·lular
Immunohematologia^ Immunoteràpia
Histocompatibilitat
Immunogenètica
Immunodeficiències
DIA 1. Separació de limfòcits de melsa (esplenòcits)^ Finalitat:^ separació física
d’un tipus cel.lular concret a partir d’una mescla cel.lular
complexa en
suspensió. Del tipus cel.lular desitjat es coneixen alguns paràmetres: la
densitat. Mètode: gradient discontinu de densitats en la que
una^ de les dues
fase s
líquides té una
densitat molt similar però
una mica^ superior
a la del
tipus cel.lular a separar. Constants a controlar:
1. Rotor vasculant^ 2. Acceleració lenta i sense fre^ 3. Temperatura ambient
1.060^ 1.070^ 1.080 plasma (alguns monòcits poc densos + plaquetes)limfòcits (+ alguns monòcits)lymphoprep (alguns neutròfils)eritròcits + neutròfils densos + eosinòfils
1.090^ 1.
1.^
densitat (g/ml)
limfòcits plaquetesmonòcits neutròfils eosinòfils
eritròcits
DIA 1. Separació de limfòcits de melsa (esplenòcits) nombre decèl.lules
exemple per la sang^ 1.0601.070^ densitat (g/ml)1.0801.0901.1001.
DIA 1. Separació de limfòcits de melsa (esplenòcits)^ eritròcits
limfòcits
centrifugació
resuspendre en PBS (segons la mida del pellet fins a 15ml PBS 20 μl de cèl.lules
barrejar i recompte 20 μl de blau tripà
DIA 1. Separació de limfòcits de melsa (esplenòcits). Recompte Colorants^ vitals.^ Substàncies acolorides que penetren la membrana cel·lular per difusió i són expulsadesactivament fora de la cèl.lula quan aquesta està viva (i manté la seva membrana intacta), Cèl.lula viva:
rodona
i refringent ; cèl.lula morta:
color blau. Els colorants més utilitzats són:
- blau tripà:^ cèl·lules vives blanques i les mortes blaves (microscopi amb llum visible).• taronja d'acridina i bromur d'etidi
: cèl·lules vives verdes i mortes taronja (microscopi de fluorescència).
0,1mm 1mm 1mm
Fòrmula de recompte:
o^ n cèls. viables totals
o^ n cèls. viables/ml = --------------------------------------------------------- x dilució amb colorant x 10.
o^ n quadrants sencers comptats
Característiques de les immunoglobulines (Igs o anticossos)
Edat^
IgG^ IgA
IgM nadó^ 830-
0-^
1-6 mesos^
311-613^ 8-
7-12 mesos^
442-880^ 19-
13-24 mesos^
553-971^ 26-
1-8 anys^
709-1179^ 34-
9-16 anys^
889-1070^ 80-
Adult^ 850-
88-^
(Ag+Ac^ (Ag+Ac
)) IC IC
Ag^ Ag
Característiques de les immunoglobulines (Igs o anticossos) Cadena L (lleugera)(212 aa) Regió frontissa^ Cadena H (pesada)(450 aa) Ac^ Ac [Ag] x [Ac]^ Kd =^
[IC] -5-12^10 M
[IC]Ka = [Ag] x [Ac]5-12 10
-1M
DIA 1-2. Estudi dels reordenaments de les cadenes variables dels
gens de les Igs de rata. Generalitats.
DIA 2. Estudi dels reordenaments de les cadenes variables dels
gens de les Igs de rata. PCR.
volum^
conc. final
H^ O dest + Taq pol (hot start).^2
15 μl^
1u
dNTPs/primers/tampó i Cl
Mg^2
5 μl^
0,2μM/20μM/1x/2mM
DNA genòmic d’esplenòcits de rata
5 μ
l^
100 ng 25 μl temps^
temperatura^
cicles
a. desnaturalització prèvia
5 min^
80ºC^
1
b. ciclat^ desnaturalització
20 segons
95ºC annealing^
15 segons^
65ºC^
45
extensió^
35 segons^
72ºC
c. extensió final
10 minuts^ 72ºC
1
DIA 3. Estudi dels reordenaments VDJ dels gens de les Igs de rata. Interpretaciódels resultats en un gel agarosa en funció de la mida i de la forma dels amplímers:^ Exemples de diferents graus de clonalitat en funció del nombre i de la forma de les bandes d’amplímer:^ a.^ Banda discreta i única
amplímer que prové d’un sol reordenament (una únicaV, D i J) b.^ Banda única d’extrems difuminats
diversos amplímers amb les mateixes V i J i diferents D c.^ Dues o més bandes discretes
diversos amplímers amb diferents V i D i la mateixa J d.^ Moltes bandes superposades que^ formen un fons de carril
moltes combinacions V, D, J diferents d^ neg^ MM neg
c^ a^ a^ a^
c^ MM^ d^
b^ neg^ b
Dia 2. Característiques de les immunoglobulines (Igs o anticossos)
límit observació llum visible
Basada en la^ capacitat de difondre
dels^ antígens
i dels^ anticossos
en suspensió a
través d’una^ matriu semisòlida
Dies 2 i 3. Determinació-quantificació d‘Igs humanes mitjançantimmunodifussió radial simple (IRS o test de Mancini). matriu semisòlida ambanticòs anti-Igs humanesa concentració constant
g1 5μl CAL ALTg2 5μl CAL MIGg3 5μl CAL BAIXg4 5μl STg5 5μl PBSg6-14^5 μ l ST 5 μl P 5 μl NP
difondre tota la nit a TA
Dia 2. Quantificació d‘Igs humanes mitjançant ELISA
Mètode analític
senzill i sensible que permet
detectar^ i^ quantificar
ICs a
concentracions molt petites. Sobre una placa de microtitulació de poliestirè de 96 pous La tècnica bàsicament consisteix en tres etapes:^ a/^ adsorció de l’antigen
(pèptids, proteïnes, polisacàrids o lipopolisacàrids bacterians) a la placa
mantenint la seva antigenicitat
,
b/^ reconeixement i unió
de l’antigen per un anticòs, tantes capes com convingui c/ eliminació de l’excés de reactius no units, d/ revelat^ de la reacció mitjançant una tècnica colorimètrica.
ELISA indirecte ELISA directe
2onanticòsunit aenzim1eranticòsantigen
