¡Descarga RESUM Métodes Instrumentals Quantitatius y más Apuntes en PDF de Análisis Químico e Instrumental solo en Docsity!
TEMA 1: Introducció a les
tècniques instrumentals
Quan quantifiquem una propietat, la tècnica que utilitzem ha de tenir una determinada qualitat metrològica. Mitjançant procediments analítics, obtenim informació d’identificació i quantificació. Per tal d’obtenir aquesta informació, necessitem seleccionar la millor tècnica. La millor tècnica serà aquella que ens proporcioni la màxima informació i la màxima qualitat. D’altra banda, hem de mirar que els materials, costos, riscs i esforços siguin mínims.
Amb els mètodes instrumentals, mesurarem una propietat analítica a partir d’un senyal. Per exemple quan mesurem l’absorbància d’un compost, estem mesurant l’espectre d’absorció a una determinada longitud d’ona de l’UV visible d’aquell compost en concret. Les tècniques instrumentals tenen sentit quan es poden fer mesures de moltes mostres i seguidament podem fer una recta de calibratge de la qual obtindrem una millor aproximació de les dades obtingudes. Definicions:
- Tècnica analítica: procés analític fonamental que és útil per donar-nos informació sobre la composició de les substàncies. (exemple: esectroscòpia d’infraroig).
- Mètode analític: aplicació específica d’una tècnica per resoldre un cas analític concret. (exemple: proteïnes totals en llet en pols).
- Procediment: conjunt d’instruccions escrites per aplicar un mètode. S’entén que l’usuari té coneixements previs de la metodologia analítica i per tant, no dóna tots els detalls sinó només les fases generals.
- Protocol: descripció detallada d’un procediment. Cal que es segueixin al peu de la lletra. Els resultats han de complir uns requisits concrets (complir una determinada normativa).
- Instrument: sistema de mesura que dóna informació analítica que es pot relacionar amb la presència o concentració de l’analit a la mostra. És a dir, la informació que dóna està directament relacionada amb els resultats analítics. (exemple: espectròmetre d’absorció molecular UV-visible, balança, cromatògraf...)
- Aparell: sistema que s’utilitza per portar a terme funcions del procediment analític però que no donen informació analítica. (exemple: microones, centrífuga, digestor, estufa...)
- Analitzador: sistema automàtic que realitza tot el procés analític, des de la presa de mostres fins al resultat.
Classificació de les tècniques instrumentals d’anàlisi:
Podem diferenciar entre dos tipus de tècniques analítiques:
- Les tècniques clàssiques o químiques són les que tenen una relació coneguda amb el senyal que analitzem i no es necessita fer un calibrat. (exemple: volumetries, gravimetria)
- (^) Les tècniques instrumentals analitzen propietats fisicoquímiques a través d’un senyal del que no se’n sap la relació i per tant, es necessita fer prèviament una recta de calibratge que ens permetrà saber la relació entre el senyal i la concentració.
Hi ha diferents tipus de tècniques instrumentals:
Classificació de les tècniques instrumentals d’anàlisi en funció de la propietat analítica:
- Òptiques: es basen en la mesura d’una propietat que té la matèria d’interaccionar amb la llum. Quan les molècules absorbeixen la llum, els electrons s’exciten però aquest estat és inestable i es retorna l’energia per tornar a l’estat fonamental i emeten llum. Hi ha 3 propietats analítiques: emissió de radiació, absorció de radiació i dispersió de la radiació.
- Elèctriques: hi trobem el potencial elèctric (ens permet conèixer el pH d’una dissolució i obtenir informació sobre la concentració dels ions), la càrrega elèctrica i la corrent elèctrica.
- Cinètiques: permet conèixer informació quan encara no s’ha arribat a l’estat d’equilibri.
- Cromatogràfiques/Separació: són tècniques que permeten separar per després poder utilitzar una de les altres tècniques per mesurar. Permeten fer una separació que es basa en la distribució de les substàncies que es troben en la dissolució.
- Espectrometria de masses: tècnica que ens permet mesurar la relació massa/càrrega.
- Immunològiques
PROCÉS ANALÍTIC Sempre que duem a terme un procés de mesura ho fem perquè volem resoldre un problema. Hem de buscar el mètode més adient i per fer-ho cal seguir una sèrie de criteris:
Exactitud
- Sensibilitat
- Límit de detecció
- Interval de concentració
- Selectivitat
Un cop seleccionat el mètode, es pren la mostra. Hem de fer una selecció per escollir les mostres que siguin representatives del que es vol analitzar i homogènies. Un cop tenim les mostres agafades, depenent de la complexitat de les mostres, aquestes s’hauran de tractar o no. També s’ha de fer una etapa de separació i purificació dins l’etapa de tractament de la mostra. Criteris numèrics per seleccionar tècniques analítiques: Precisió : per calcular la precisió d’un mètode el paràmetre més utilitzat és la desviació estàndard relativa. Exactitud : necessitem comparar el nostre valor amb el valor veritable, aquest últim el podem saber a partir d’uns materials certificats que comprem, els quals sabem exactament el que contenen. Analitzem el material certificat amb els nostres instruments, si el valor obtingut es troba entre el interval que ens diuen serà un bon mètode. Sensibilitat : s’observa amb la sensibilitat de la nostra recta de calibratge. Límit de detecció : quantitat mínima d’analit fàcilment distingible del senyal del blanc. Límit de quantificació : quantitat d’analit a partir de la qual podem començar a quantificar. Tècniques de purificació per tractar la mostra i obtenir extractes nets que es puguin aplicar en instruments i analitzar:
.4 (^) Extracció de la proteïna i solubilització
- Fraccionament
- Cromatografia: canvi iònic, gel filtració, hidrofòbic, afinitat (amb anticossos)
TEMA 2. Tècniques òptiques d’anàlisi quantitativa (I)
Les tècniques òptiques es basen a mesurar propietats òptiques de les substàncies a partir de l'absorbància i l'emissió.
L’espectre electromagnètic és el conjunt de totes les possibles ones electromagnètiques des de les de menor longitud d’ona, com els raigs gamma i raigs X, fins a les de major, com les ones de ràdio. L’energia i la longitud d’ona són magnituds inversament proporcionals.
- És molt important saber en quina franja de l'espectre es troba cada materia, ja que cada procès és exclusiu d'una regió d'aquest, equivalent a un rang d'energia.
- Dins l'assignatura ens centrarem a la zona d'ultraviolada visible ja que ens permet estudiar les transicions d'electrons externs perquè té la suficient energia per realitzar-les.
- Una molècula pot absorbir energia a diferents rangs de l'espectre.
Per tal que un electró pugui passar d'un nivell a un altre es necessita energia, la qual és obtinguda en el procés d'absorció. Les diferents possibilitats d’excitació que pot patir un electró s’anomenen transicions i corresponen a una longitud d’ona en concret.
Cal diferenciar entre els espectres atòmics i els moleculars:
- (^) Els espectres atòmics estaran formats per línies ja que els nivells electrònics no tenen subnivells energètics. Quan l’electró absorbeix energia, passa de l’estat fonamental a l’estat excitat, de manera que només hi ha una possibilitat de transició. Podem mesurar l'energia que absorbeix per pujar de nivell o la que emet per baixar-ne a partir de la longitud d'ona.
- Els espectres moleculars estaran formats per bandes ja que dins de cada nivell energètic, hi
ha diferents subnivells de vibració. Els electrons de les molècules en cada estat fonamental o
excitat poden estar en un cert número de subnivells energètics (vibratoris i rotatoris) i els salts d’aquests es poden donar en un ampli ventall de longituds d’ona.
Cada molècula presenta un màxim d’absorbància i serà en aquella determinada longitud d’ona on tindrem la màxima sensibilitat per detectar la transició, degut a que el nivell màxim d’absorbància representa el salt d’energia que es produeix més sovint.
Espectrofotometria:
Per tal de poder aplicar les tècniques òptiques d’anàlisi caldrà que poguem mesurar l'absorbància d'un analit a partir (generalment) d'un espectrofotòmetre.
Un dels aparells bàsics que utilitzarem serà l’espectrofotòmetre. Podem trobar dos tipus d’espectrofotòmetres al mercat:
- Espectrofotòmetre d’únic feix: s’utilitza el valor del blanc com a zero de l’escala.
- Espectrofotòmetre de doble feix: un feix de llum passa per la cubeta de la mostra i l’altre per la cubeta del blanc i alhora, fa la relació dels valors.
En tots dos tipus d’espectrofotòmetres necessitem una làmpada per tal de produir l'emissió d'energia i que el feix de llum emès sigui el més estret possible per tal d'ajustar-se el màxim a la longitud d'ona, ja que hem de recordar que s'escull una determinada longitud d’ona per a cada substància per tal d’obtenir el seu punt màxim d’absorbància.
CAL RECORDAR QUE: L’instrument calcula la diferència entre la potència de llum incident i la transmesa. El detector però, realment calcula la llum que NO ha estat absorbida, és a dir, la transitància. I després es calcula l'absorbància a partir d'una equació (Llei de Beer-Lambert)*
- Llei de Beer-Lambert L’equació de la Llei de Beer-Lambert és:
Serà molt important fixar-nos en el coeficient d’extinció molar o d’absortivitat molar, ja que és específic de cada substància i depèn de la longitud d’ona a la qual realitzem la mesura (e).
A = Absorbància L = Concentració E = Absorvitat molar c = Camí òptic (casi sempre igual)
Un altre paràmetre a tenir en compte a banda de l'espectrofotòmetre és el tipus de dissolvent que utilitzem. Segons en la longitud d’ona que treballem, hi ha determinats dissolvents que poden absorbir radiació a aquella determinada longitud d’ona i per tant produir errors a l'hora de la mesura de l'absorbància que presenta l'analit (ja que també absorbiria el dissolvent). El mateix passa amb el material de la cubeta que utilitzem i amb lo neta que aquesta estigui, ja que les taques no deixen passar la llum i segons el material de la cubeta aquesta pot presentar absorbància a una determinada longitud d'ona (s'utilitza el quars per infraroig i el plàstic per llum visible). El volum de la mostra també seria un paràmetre a tenir en compte, però actualment, totes les cubetes tenen una mida estàndard. Si controlem tots els paràmetres anteriors, tindrem una major sensibilitat en els resultats.
Per tal de poder interpolar el valor d’absorbància de les mostres i saber-ne la seva concentració, prèviament hem hagut de fer una recta de calibratge. Aquesta recta s’obté a partir del procés de quantificació mitjançant la mesura de l’absorbància de diferents mostres de concentració de cromòfor coneguda. S'ha de tenir en compte que mai podrem obtenir un resultat exacte de concentració degut a que a la recta sempre hi ha un marge d'error, que es produeix més fàcilment contra més petita es la concentració a mesurar o interpolar.
Aplicacions en bioanàlisi :
Per tal de tenir una bona sensibilitat a l'hora de percebre una transició i mesurar-la ens interessa
que el nivell d'absorvilitat molar sigui molt elevat. Això és degut a que en una recta de calibratge el pendent és la sensibilitat, i a l'equació utilitzada a l'espectrofotometria el pendent es eb (A=ebc) on b és gairebé una constant i e absorvilitat molar.
A més a més, per tal de poder observar la transició correctament necessitem que aquesta es faci en una zona de l'espectre observable, que ja pot ser a la ultraviolada propera (superior als 230nm de longitud d'ona) o molt millor, a la regió visible (a valors de longitud d'ona superiors al 300nm). En longituds d'ona inferiors és molt difícil percebre-les de forma clara.
- L ’ultraviolat llunyà de proteïnes: L ’enllaç peptídic (Aplicació: Detectar la presència d'aminoàcids)
Els electrons π de l’enllaç peptídic, deslocalitzats entre els àtoms de O, C i N, donen lloc a la transició principal π π* d’aquest grup molecular. La banda s’observa a 190nm aproximadament amb una absortivitat molar de 7000cm 2 ·mol -1. Una altra transició del grup peptídic observada entre 210nm i 220nm correspon a una transició prohibida per les regles de selecció i per tant és de baixa probabilitat (n π) i presenta un coeficient d’absortivitat molar petit d’aproximadament 100cm*^2 ·mol -1.
Algunes cadenes laterals d’alguns aminoàcids, tenen transicions a l’entorn de longituds d’ona de 210nm. No obstant, aquestes absorcions no es poden observar normalment en proteïnes perquè estan emmascarades per l’absorció més intensa dels grups amida de l’esquelet polipeptídic ja que són més nombrosos.
El rang de la radiació UV més útil està per sobre dels 230nm, on l’absorció del grup peptídic es redueix a valors despreciables. D’aquesta manera, a l’interval de 230-300nm de la regió UV propera, trobem pics d’absorbància de les cadenes laterals dels aminoàcids aromàtics Phe, Tyr i Trp.
–Diferenciació entre citocroms
Un citocrom és una proteina unida a un grup hemo que s'encarrega d'intervenir en les reaccions redox i així produir ATP. Això és possible degut a que el grup hemo presenta Ferro, que pot passar d'estat oxidat a reduit i a la inversa (Fe 2+^ Fe^ 3+). Hi ha tres tipus de citocrom (a, b i c) que es diferencien entre si pels seus
espectres d'absorbància. A més a més, un mateix citocrom es pot trobar reduit o oxidat (per la precència de ferro) i canviar així el seu nivell d'absorbància segons estigui present en una forma o una altre a una mateixa longitud d'ona.
Per últim, el citocrom C es troba involucrat en el transport d'oxigen a la sang i segons si porta o no una mol·lècula d'02 unida té un espectre d'absorció o un altre, fet que ens permet diferenciar entre la oxihemoglobina i la desoxihemoglobina.
Els nucleòtids absorbeixen llum visible altament en longituds d’ona de 260nm. Aquest fet proporciona un gran avantatge ja que al prendre mesures evitem la contaminació de la mostra
per proteïna ja que les proteïnes absorbeixen longituds d’ona de 280nm. La propietat de poder mesurar a longituds d’ona de 260nm ens serveix com a estàndard per detectar organismes modificats genèticament (detecta M60, present en aquests aliments).
- (^) Bioluminescència: és el fenomen de quimioluminescència que té lloc dins d’un ésser viu.
Fonament de la fotoluminescència
Totes les substàncies que poden absorbir llum (saltant a estats excitats), també la poden emetre. L’emissió de llum és una manera de retornar a l’estat fonamental.
Per entendre la diferència entre la fosforescència i la fluorescència, ens hem de fixar en els spins dels electrons que donaran diferents estats excitats anomenats singlet o triplet.
Quan un electró absorbeix una determinada radiació i passa a l’estat excitat, pot fer-ho de dues maneres:
- Parlarem de singlet en el cas que un electró de l’estat fonamental passi a un estat excitat i estigui aparellat amb l’electró de l’estat fonamental, és a dir, els estats dels spins estaran oposats. Aquest fenomen produirà la fluorescència.
- Parlarem de triplet en el cas que excitem la mostra i un dels electrons de l’estat fonamental passi a un estat excitat, però l’estat de l’spin de l’electró que ha quedat a l’estat fonamental sigui igual que el de l’excitat. Aquest fenomen produirà la fosforescència.
La velocitat en la qual s’absorbeix un fotó de radiació és enorme. D’altra banda, l’emissió fluorescent té lloc a una velocitat significativament més lenta. El temps de vida de l’estat excitat es relaciona inversament amb l’absortivitat molar del pic d’absorció corresponent al procés d’excitació. Per tant, per absortivitats molars elevades, els temps de vida de l’estat excitat seran curts (fluorescència); en el cas que les absortivitats molars siguin baixes, els temps de vida de l’estat excitat seran llargs (fosforescència). Cal recordar que la velocitat de promig d’una transició triplet a singlet és menor que la corresponent transició singlet a singlet. És per aquest motiu que l’emissió fosforescent requereix temps més llargs que l’emissió fluorescent.
En el següent diagrama de Jablonksi podem observar que perquè es produeixi un fenomen de fotoluminescència primerament es necessita un fenomen d’absorció. Cal destacar que l’excitació directa a un estat triplet és una transició prohibida i per tant primer s’ha de passar per un estat singlet excitat. Això fa que la fluorescència sigui molt ràpida (temps d’absortivitat molar elevats, per tant temps de vida curts) però la fosforescència no, ja que abans de produir-se, hi ha d’haver un creuament entre sistemes. Un creuament entre sistemes és el canvi d’orientació de l’spin d’un electró i per tant passem d’un estat singlet a un triplet. Aquest fet és més fàcil si hi ha un solapament dels nivells vibracionals. Un cop s’ha produït el creuament entre sistemes, l’electró pot retornar a l’estat fonamental mitjançant l’alliberament d’un fotó.
Aquesta emissió del fotó és el que es coneix com a fosforescència.
Podem observar també que l’energia emesa sempre és inferior a la captada degut a fenòmens de relaxació vibracional o conversions internes.
Una molècula excitada pot tornar al seu estat fonamental mitjançant una combinació de diferents etapes. La fluorescència i fosforescència comporten l’emissió d’un fotó de radiació.
Les etapes de conversió interna, relaxació vibracional o creuament entre sistemes són
processos que no emeten radiació. El millor camí per retornar a l’estat fonamental serà aquell que minimitzi el temps de vida de l’estat excitat. És per aquest motiu que tindrem fluorescència si és més ràpida que els processos que no emeten radiació. En el cas que sigui el contrari, no es produirà o ho farà en menys intensitat.
Pel que fa els processos de relaxació vibracional, són deguts a les col·lisions entre molècules de les espècies excitades i les del dissolvent. El resultat és una transferència d’energia i un increment molt petit de la temperatura
del dissolvent.
Pel que fa la conversió interna, són els processos intermoleculars pels quals la molècula passa a un estat electrònic de menor energia sense emetre radiació. Aquests processos no estan ben definits ni s’entenen bé però és evident que són molt eficaços ja que trobem pocs compostos que presenten fluorescència. La conversió interna pot ser eficaç quan dos nivells d’energia electrònics estan suficientment pròxims com perquè hi hagi un solapament dels nivells d’energia
vibracional. La conversió interna a través dels nivells vibracionals solapats és normalment més probable que la pèrdua d’energia per fluorescència des d’un estat excitat més alt.
- Que l’escala de temps sigui igual en fluorescència que a nivell molecular, ens permet obtenir més informació de l’absorbància o dels dos àtoms que formen l’enllaç i també de l’entorn.
Comparació entre UV-VIS i Fluorescència
Si comparem les dues tècniques de la taula, podem observar que UV-VIS té un interval de linealitat més elevat que el de la fluorescència fet que permet fer mesures en un interval d’absorbància o radiació més elevat però la fluorescència serà més sensible i selectiva. La selectivitat permet que aquest mètode mesuri diferents longituds d’ona, tant la d’excitació com la d’absorció, mentre que el mètode anterior només pot mesurar la d’absorció. A més a més, una alta sensibilitat proporciona un major grau d’exactitud en la mesura ja que permet diferenciar dos valors molt propers.
Factors que afecten a la fluorescència
Tant l’estructura molecular com l’entorn químic, influiran en què una substància sigui o no luminescent. Aquests factors també determinen la intensitat d’emissió quan té lloc la fotoluminescència.
- Longituds d’ona d’excitació: és important ressaltar que la fluorescència rarament és conseqüència de l’absorció de radiació ultraviolada de longituds d’ona menors de
250nm ja que aquesta radiació és suficientment energètica com per produir la desactivació dels estats excitats per dissociació dels enllaços.
Una molècula en el seu estat electrònic excitat normalment passa al seu estat excitat més baix mitjançant una sèrie de relaxacions vibracionals ràpides i conversions internes que no produeixen emissió de radiació. D’aquesta manera, la fluorescència sorgeix, generalment, d’una transició des del nivell vibracional més baix del primer estat electrònic excitat a un dels nivells vibracionals de l’estat electrònic fonamental.
- Vida mitja del fluoròfor: si volem el fenomen de fosforescència necessitem temps de vida llargs però si volem tenir fluorescència, necessitem temps de vida curts. Això implica tenir absortivitats molars elevades.
Empíricament s’observa que la fluorescència es troba més freqüentment en els
compostos en els que la transició de més baixa energia és del tipus π F 0 E 0 π* que en aquells compostos en els que la transició de menor energia és del tipus n F 0 E 0π. La major eficàcia quàntica associada a la transició π F 0 E 0 π es pot explicar de dues maneres. Primer, l’absortivitat molar és molt més elevada que el procés n F 0 E 0π*. D’aquesta manera, la primera transició té temps de vida més curts que la segona i és més favorable per la fluorescència. D’altra banda, el solapament dels nivells vibracionals del triplet amb els del singlet es menys probable i per tant, menys possibilitats que es produeixi el creuament entre sistemes. D’aquesta manera, podem determinar que la
Factors del medi
- INFLUÈNCIA DEL SOLVENT: pot haver-hi ha una desactivació del fenomen de fluorescència perquè l’electró excitat es pot situar a un dels subnivells del solvent. Si l’electró torna al seu estat fonamental a través d’un orbital excitat del solvent, la longitud d’ona és més gran i per tant, menys energia. Aquest efecte té més presència com més polar sigui el solvent.
- INFLUÈNCIA DEL PH: la fluorescència d’un compost aromàtic amb substituents àcids o bàsics a l’anell depèn normalment del pH. Tant la longitud d’ona com la intensitat d’emissió són probablement diferents per les formes ionitzades i no ionitzades del compost. Els canvis en l’emissió dels compostos d’aquest tipus sorgeixen del diferent nombre d’espècies ressonants associades a les formes àcides i bàsiques de les molècules. Com major sigui el número de formes ressonants, major és l’estabilitat del primer estat excitat; la conseqüència és una fluorescència a la regió ultraviolada. El pH afectarà sobretot en el grup funcional de la molècula. És un factor que s’ha de controlar molt bé. Hem de tenir en compte que les constants de dissociació també varien en l’estat excitat i no són les mateixes que les de l’estat fonamental. Preferirem tenir una espècie neutre amb moltes formes ressonants que una espècie carregada i que no tingui formes ressonants ja que la ressonància augmenta la fluorescència.
- INFLUÈNCIA DE LA TEMPERATURA: l’eficàcia de la fluorescència disminueix amb l’augment de la temperatura ja que això provoca un augment de xocs que a la vegada augmenta la probabilitat de les conversions internes (disminució d’energia sense emetre fluorescència).
- INFLUÈNCIA DE L’OXIGEN DISSOLT: l’oxigen és un oxidant i pot provocar reaccions redox. Cal tenir en compte que és una molècula paramagnètica i pot afavorir el
creuament entre sistemes i la conversió de les molècules excitades al triplet. Per tant,
disminueix la fluorescència (fenomen conegut com a Quenching F 0 E 0atenuació de la fluorescència).
Efecte del solvent i de l’entorn local sobre la fluorescència (desplaçament de l’espectre d’emissió a longituds d’ona superiors)
- Rendiment quàntic: és la relació entre el número de molècules que emeten luminescència respecte el número total de molècules excitades. Per molècules altament fluorescents com la fluoresceïna, el rendiment quàntic s’aproxima a la unitat. La fluoresceïna és una molècula molt selectiva perquè és molt difícil que hi hagi substàncies que coincideixin en les longituds d’ones d’emissió i les d’absorció. La selectivitat ens interessa perquè no hi hagi interferències. Les espècies químiques que no presenten una fluorescència apreciable, tenen rendiments que s’aproximen a zero.
També hem de tenir en compte que depenent del solvent que utilitzem, el color de la dissolució és diferent i per tant, l’absorció es produeix a diferents longituds d’ona.
Paràmetres a mesurar en fluorescència
La representació gràfica de la intensitat de fluorescència respecte la concentració del compost, podem observar que hi ha una relació lineal. Cal dir però que a concentracions molt elevades, aquesta linealitat es perd i a l’hora de fer l’extrapolació de la mostra a la recta no serà fiable.
Hi ha altres factors responsables també de desviacions de la linealitat a elevades concentracions com l’autoatenuació i l’autoabsorció. L’autoatenuació és el resultat de les col·lisions entre les molècules excitades. L’autoabsorció té lloc quan la longitud d’ona d’emissió se solapa amb un pic d’absorció; la fluorescència després disminueix perquè la radiació emesa travessa la dissolució i es reabsorbida per altres molècules fluorescents.
Gràcies a aquestes desviacions, podem detectar que s’estan formant dímers o agregats.
Espectres d’emissió i d’excitació
Els espectres d’excitació s’obtenen mesurant la intensitat lluminosa a una longitud d’ona fixa (longitud d’ona d’emissió fixa) mentre es varia la longitud d’ona d’excitació. Com que la primera etapa per la generació de l’emissió fluorescent és l’absorció de radiació (s’obtenen estats excitats), un espectre d’excitació és pràcticament idèntic a un espectre d’absorció realitzat sota les mateixes condicions. D’altra banda, els espectres de fluorescència i fosforescència, suposen l’excitació a una longitud d’ona fixa mentre es registra la intensitat d’emissió com a funció de la longitud d’ona (longituds d’ona variables). Les bandes fosforescents es troben a longituds d’ona més llargues que les bandes de fluorescència ja que
