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TEMA 5: TOXICOLOGÍA DEL DESARROLLO:
EMBRIOLETALIDAD y TERATOGENICIDAD
Es el estudio del deterioro de la función o capacidad reproductora de machos y hembras, así como la inducción de efectos nocivos no hereditarios en la descendencia.
Tienen lugar una serie de efectos adversos producidos por la exposición a determinados compuestos químicos en organismos en estado embrionario y/o fetal.
EMBRIOLETALIDAD : efectos tóxicos irreversibles incompatibles con la supervivencia.
TERATOGENICIDAD: efectos tóxicos irreversibles que pueden producir retraso en el
desarrollo y crecimiento intrauterino y anomalías funcionales y morfológicas.
DISRUPTORES ENDOCRINOS
Son compuestos exógenos (xenobióticos) con efectos negativos sobre la salud del organismo intacto o sobre su descendencia, porque intervienen sobre la función endocrina. Principalmente alteran la función reproductora.
Efectos que producen:
- Alteración en función tiroidea (aves, peces)
- Disminución de la fertilidad (aves, peces)
- Disminución de la eficacia en la incubación (aves, peces)
- Desmasculinización y feminización en machos (peces, aves, mamíferos)
- Desfeminización y masculinización en machos (peces, aves, mamíferos)
Los disruptores endocrinos comparten similitudes estructurales con el estradiol.
SUSTANCIAS QUÍMICAS NATURALES
Son moléculas con actividad estrogénica semejantes al estradiol. Principalmente son hormonas naturales no esteroideas.
Ejemplos:
- Estrógenos naturales de origen natural y vegetal
- Pesticidas: DDT (se prohibió porque provoca alteración en la reproducción de las aves)
- Herbicidas: los que tienen cloro en su estructura principalmente.
- Fungicidas: los derivados del estaño.
- Sustancias que se generan en la industria química debido a la combustión: hidrocarburos aromáticos policíclicos, dioxinas, furanos.
- Sustancias de acción prioritarias (agentes químicos del medio ambiente): talatos, bisfenoles (forman parte de los plásticos y pueden pasar a los alimentos por migración).
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS XENOBIÓTICOS ESTROGÉNICOS
- Persistentes
- Lipofílicos
- Tienden a acumularse en el tejido graso.
COMPUESTOS ORGÁNICOS QUE INTERFIEREN EN EL SISTEMA HORMONAL
Características:
- Se mimetizan con la acción de las hormonas (agonistas)
- Antagonizan la acción de las hormonas.
- Alteran su patrón de síntesis y metabolismo
- Modulan los niveles de los receptores.
Ejemplos:
- Receptor de retinoides
- TBT (tributilo de estaño) en el ambiente:
- degradación lenta.
- se acumulan en agua y sedimentos y se bioacumulan
se utilizan en pinturas de barcos para conservar la madera
provocan alteraciones en peces y gasterópodos: aumentan el número de machos frente al de hembras y producen la masculinización de hembras.
bloquean la transformación de andrógenos a estrógenos porque inhiben la aromatasa (enzima CYP450)
GRADO DE SUSCEPTIBILIDAD DURANTE EL DESARROLLO DEL
ORGANISMO
La susceptibilidad a los teratógenos varía con el estado de desarrollo del organismo, por lo que depende del momento de exposición y de la dosis del tóxico.
FASE DE PREIMPLANTACIÓN: la exposición del embrión a tóxicos durante este periodo le puede ocasionar la muerte, aunque también puede sobrevivir gracias a la hiperplasia compensadora que tiene lugar. Durante la fase, la exposición a tóxicos no es causa de malformaciones congénitas.
FASE EMBRIONARIA: es el periodo de máxima susceptibilidad a los compuestos tóxicos, ya que la mayoría de las veces el daño producido es irreversible. La exposición durante la organogénesis origina malformaciones estructurales.
FASE FETAL y PERINATAL: durante estos periodos se produce la maduración funcional de los órganos y sistemas. La exposición a un teratógeno produce retraso en el crecimiento y déficits funcionales.
Cuadro resumen:
PATRONES DE TOXICIDAD EN EL DESARROLLO
Las manifestaciones del desarrollo anormal aumentan en frecuencia y grado en una relación dosis-respuesta.
Los teratógneos provocan:
- Embriletalidad
- Retraso en el crecimiento
- Malformaciones morfológicas y funcionales
Las lesiones dependen del:
- Compuesto
- Momento de exposición
- Dosis
TIPOS DE COMPUESTOS
- COMPUESTOS ESTRICTAMENTE TERATOGÉNICOS : son compuestos que afectan a procesos específicos de diferenciación y desarrollo de la célula. Mecanismos de acción teratógena: - Capacidad citotóxica. - Inhiben el crecimiento celular. - Inhiben procesos como la fosforilación oxidativa y glucolisis. - Inhiben la síntesis de ARN. - Afectan a la homeostasis materna o placentaria. Ejemplos: glucocorticoides, anticonvulsivantes, alcohol [gráfica 10]
- COMPUESTOS ESTRICTAMENTE EMBRIOLETALES : son compuestos que afectan a procesos no específicos de diferenciación y desarrollo, es decir, a procesos globales. A bajas concentraciones provocan retrasos del desarrollo. A concentraciones superiores producen la muerte del feto. Ejemplo: cloranfenicol [gráfica 11]
OCDE : organización para la cooperación y el desarrollo económico. Tiene una serie de
apartados generales divididos en secciones específicas para determinar la toxicidad de las sustancias. No todos los ensayos están validados
- Métodos para la determinación de las propiedades físico-químicas.
- Métodos para la determinación de la toxicidad. (para extrapolar luego a humanos)
- Métodos para la determinación de la ecotoxicidad.
TEST DE TOXICIDAD AGUDA : determina la dosis que produce un 50% de mortalidad a dosis única. Consiste por tanto en obtener las DL50. Están en función de la variable tiempo. Con estos ensayos se utilizan muchos animales.
Con el método generalista, los ensayos de toxicidad aguda se van a realizar con exposiciones únicas o repetidas. No es lo mismo que el compuesto se administre por vía oral o inhalada. Con un método específico, se realizan ensayos de mutagenicidad.
Los animales generalmente utilizados son roedores (excepcionalmente otras especies). Tratan de minimizar el nº de animales empleados para dar con la información que se busca. Obtener información, antes de trabajar con líneas celulares, obtener datos previos al estudio in vitro.
TOXICIDAD ORAL AGUDA : los efectos adversos aparecen tras la administración de una única dosis de una sustancia, o de múltiples dosis dentro de las primeras 24h. TOXICIDAD DÉRMICA AGUDA : efectos adversos causados por una sustancia seguidos de una única e ininterrumpida exposición dérmica durante un corto periodo de tiempo (24h o menos). Se utiliza al conejo porque es más sensible que las ratas. El compuesto se administra vía dérmica o en el ojo. TOXICIDAD INHALATORIA AGUDA : efectos adversos causados por una sustancia seguidos de una única e ininterrumpida exposición inhalatoria durante un periodo de al menos 4h de una sustancia capaz de ser inhalada.
TEST DE TOXICIDAD SUBCRÓNICA : determina la máxima dosis diaria de compuesto químico compatible con la vida del animal.
TEST DE TOXIDAD CRÓNICA : determina los efectos tóxicos durante la vida completa de un animal de laboratorio.
TEST DE TOXICIDAD AGUDA
Los animales utilizados son principalmente ratas y ratones. Excepcionalmente se utilizan otras sp. (conejos, perros…). Tratan de minimizar el número de animales que se utilizan.
Se obtiene información de las moléculas antes de comenzar el estudio de los tóxicos.
Se administra 1 única dosis o varias en cortos de periodos de exposición.
El periodo de análisis es durante 14 días; si después de estos días el animal no ha muerto se le sacrifica para obtener todos los datos posibles (peso corporal, cuanto come, cuanto bebe…). Se dan los resultados en curvas de dosis-respuesta en las que se valora la mortalidad, el aumento o disminución del peso…
Tras la muerte se debe realizar la necropsia y tomar muestras para histopatología.
Los resultados nos informarán del porcentaje de mortalidad y si afecta en los parámetros que interesan (si es el peso, si ha aumentado o disminuido, por ejemplo)
Es conveniente calcular la DL50 por la función transformada de “probit” para establecer una relación entre el estudio in vitro-in vivo. De esta forma se minimiza el nº de animales así como las dosis a utilizar.
Ejemplos:
Test 425 : normalmente utiliza 1 o 2 ratas hembras por dosis, que se administran cada 48h en los animales, pero no en todos a la vez, si no de forma secuencial para ir ajustando las dosis.
Test 420 o de dosis fijas : se forman grupos de animales de un solo sexo (principalmente hembras, ya que son más sensibles). Se administran dosis fijas y se va subiendo la dosis hasta que se encuentra el efecto tóxico. En el caso de usar dosis fijas, tenemos un animal que se le aplica una dosis fijada, y que tras obtener resultados se estudia en 5 animales. Se va escalando las dosis hasta que se encuentra el efecto tóxico.
Se debe observar al menos una vez durante los primeros 30 min; y periódicamente durante las primeras 24h.
Si tenemos un indicio de que el animal se encuentre:
- Con síntomas de toxicidad, sirve para el estudio principal con 5 animales. Todos ellos reciben la dosis.
Si se mueren 2 de 5, ir al protocolo para administrar una dosis más pequeña
Si no hay síntomas, ir al protocolo para administrar una dosis mayor
Test 423 o de clase tóxica aguda : utiliza 3 animales de cada sexo y lo que se valora es la muerte del animal. Otro método, se estudia por sexos. Se realizan con 3+3 animales. Se comienza directamente sin estudio previo. Es muy parecida a la anterior. La vía de administración más común es la oral y seguidamente la inhalatoria. Se requieren 4h. de exposición.
ECOTOXICIDAD
En 1790-1857 Marshall Hall, fue un científico inglés que en 1831 estipuló 5 principios que rigen la experimentación animal:
- Un experimento nunca debe ser realizada si la información necesaria puede obtenerse a través de observaciones
- Ningún experimento debe ser realizado sin un claramente definido y obtenible, objetivo
- Los científicos deben estar bien informados sobre el trabajo de sus predecesores y compañeros con el fin de evitar la repetición innecesaria de un experimento
- Experimentos justificables debe llevarse a cabo con la inflicción lo menos posible de sufrimiento (a menudo mediante el uso de animales inferiores, menos sensibles)
- Todo experimento debe ser realizado bajo circunstancias que proporcionan los resultados más claros posibles, disminuyendo así la necesidad de repetición de experimentos.
Años más tarde, en 1959, Sussell y Burch propusieron la norma de las 3R:
Reducción del nº de animales Refinamiento de los procedimientos Reemplazamiento con métodos alternativos y complementarios (incluso una 4R: responsabilidad)
Hoy en día, está en vigor la directiva 86/609/CE que dice:
- Los experimentos deberán ser realizados por personal autorizado y siempre bajo la Legislacion de los Paises
- No deberán realizarse si existe otro método alternativo científicamente satisfactorio
- Si se ha de realizar un experimento con animales, la elección de la especie y su número será tal que involucre el mínimo número y con el menor desarrollo.
Hay una serie de sustratos biológicos para ensayar la toxicidad. Pueden ser material orgánico vivo o no. Los indicadores de tóxicos son parámetros que determinamos para cuantificar el efecto.
Los valorados son aquellos que determinan el grado de toxicidad.
El sustrato biológico va desde modelos supracelulares hasta modelos libres de células. Podemos utilizar microorganismos, células y tejidos animales, células y tejidos vegetales; o tejidos u órganos perfundidos (muchas veces se tienen que sacrificar al animal para ello)
El sustrato más utilizado son los cultivos celulares (cualquier célula que se extraiga del cuerpo) ya que presentan muchas características.
La utilización de células cultivadas (líneas celulares establecidas) es un método más rápido y económico. Existen muchos tipos de células especificas permiten el estudio de la respuesta frente a un tóxico. Las células transformadas son aquellas genéticamente alteradas. El contexto puede alterar la respuesta ya que puede que se pierda la estructura tridimensional.
Los cambios se pueden observar mediante microscopio óptico, electrónico, con una citometría de flujo… La viabilidad celular estudia la citotoxicidad.
ENSAYOS TOXICOLÓGICOS: TOXICIDAD IN VITRO
Los métodos son muy pocos. Los que no implican genotoxicidad, abarcan:
- Viabilidad celular directa: en suspensión (utilizando microscopio o contadores electrónicos)
- Viabilidad celular indirecta: en monocapa (estudiando la integridad de la membrana, realizando ensayos de funcionalidad y también ensayos con marcaje DNA)
CONTAJE DE CÉLULAS
Hemocitómetro: método electrónico para contar células. Su uso es amplio en biomedicina para contaje de células sanguíneas en investigación bacteriológica
Test de citotoxicidad (monocapa): rápidos y sencillos, valorando antes la concentración en poco tiempo. El crecimiento o sus alteraciones son valorables:
- Poner células expuestas a un agente tóxico a diferentes concentraciones
- Usar marcadores colorante (sales de MTT) Te permite ver alteraciones de proteína, valorando la cantidad alterada (permite la cuantificación)
Rojo neutro: Colorante que se acumula en las células funcionales. Aquellas que no son viables no se colorean, los lisosomas no captan el colorante y se expulsa. Así podemos obtener mucha información de aquellas concentraciones tóxicas que provocan alteraciones.
Hay métodos por los cuales podemos hacer mapas genéticos de expresión de mRNA.
Cuando se da un compuesto al animal, se debe tener en cuenta su repercusión en el medio ambiente, una vez que se excrete este compuesto o sus metabolitos.
por un toxico en aquellas en la que la bacteria no muestra luminiscencia, debido a que no puede utilizar ATP porque el tóxico interfiera.
- Las porciones de ecosistema (mesocosmos), se utiliza en animales acúaticos (fotosíntesis, respiración…) por ser más sencillo.
MICROCOSMOS MESOCOSMOS Pequeño tamaño Gran tamaño Ecosistema altamente definido Ecosistema menos definido Fácil de mantener (barato) Difícil de mantener (caro) Moderado nivel de realismo ambiental Alto nivel de realismo ambiental
La OCDE no dice que deben tener:
- Sedimentos: de suministros para estanques o sistemas naturales
- Agua: de la zona donde se han recolectado los sedimentos y los organismos
- Organismos que debe incluir: fitoplacton, macrófitos (flotantes, sumergibles), invertebrados (bentónicos, planctónicos), peces (deben ser introducidos cuando el ecosistema esté establecido)
Identificación de carcinógenos
1.- Investigaciones epidemiológicas en humanos
- Dificultad para distinguir múltiples exposiciones
- Inadecuado historial de exposiciones *Dificultad para evaluar los efectos de exposición recientes
2.- Estudios en animales de experimentación (animales test, 50 animales por grupo, 2 años, estudios caros)
- Diferencias en los valores de los procesos metabólicos, entre los ensayos…
Por ello es mejor conocer su potencial toxico antes de comenzar el ensayo, basándonos en los experimentos de mutagenicidad (ya que hay una estrecha relación entre mutagenicidad y cáncer)
Muchos son en microorganismos (bacterias y levaduras) por ser sencillos y rápidos (E.coli; Salmonella…) Otros son sobre células de mamíferos (eritrocitos, espermatogonias…) Otros sobre el daño y reparación en la síntesis de DNA.
El más clásico, barato y rápido es el test bacteriano. Las desventajas es que un microorganismo es diferente a una célula de mamífero.
El test de Ames, ensayo de mutación bacteriano que emplea Salmonella typhimurium como bacteria indicadora, ha sido universalmente adoptado para la detección de mutágenos, siendo quizás la más difundida de las pruebas para detectar, en forma simple, rápida y económica, el poder mutagénico de diversas sustancias 12. En el mismo se cultivan cepas de S. typhimurium genéticamente modificadas, de modo que requieren histidina para su crecimiento, en presencia y ausencia de la droga a ensayar, en un medio sin histidina. Una sustancia mutagénica puede revertir esta carencia, haciendo que las bacterias crezcan en el medio sin histidina (dando colonias llamadas revertantes). Según el test de Ames una sustancia, natural o sintética, se considera mutagénica cuando el coeficiente de reversión, C.R., es mayor que 2. C.R. = Nº de colonias revertantes por placa ensayada/ Nº de colonias revertantes por placa control -espontáneas-)
Células de mamífero micronúcleos, se pretende observar un pequeño cuerpo cromático en la vecindad del núcleo es un fragmento acéntrico procedente de una delección. Miden mutaciones, aberraciones cromosómicas que dependen del compuesto y las dosis, a las que se ha sometido el animal. Obtener cromosomas en metafase y ver las posibles mutaciones.
Ensayo del cometa, detecta lesiones DNA en células eucariotas individuales. Aquellos fragmentos lesionados que aparecen en los alrededores del núcleo en forma de cometa infica mutagenicidad.
Fertilidad y teratogenicidad
Test in-vitro (células de cérvix)
El receptor activa una luciferasa, lo que permite observar los resultados dependiendo de la luminosidad. Cuando más se una al receptor, más luminosidad y por tanto más cancerígeno.
Test in-vivo
Hay unos encaminados a estudiar el efecto en una generación y otros yendo más allá (dos o más generaciones)
- Segmento I: evalúa la fertilidad. Se administra a los machos y hembras antes del periodo de gestación evaluando así queda afectada la capacidad de fertilidad. Veremos:
- Embrioletalidad pre y post implantación
- Malformaciones esqueléticas
- Retraso en el crecimiento
A estas madres se las sacrificará, si no presentan esta clínica se dejan que desarrolle la gestación.
- Segmento II: evalúa la toxicidad del desarrollo. Cuando son distintas generaciones, se van seleccionando con un periodo de dosificación (mucho más largo), recogiendo todos los datos informativos.
