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Alumna: Stefanía Vieira Título: ESTUDIO DE LA FOSFATASA ALCALINA EN CONDICIONES DE ESTADO ESTACIONARIO – TRABAJO PRÁCTICO II Objetivos: Determinar la velocidad de hidrólisis de fenilfosfato por la fosfatasa alcalina en función de la concentración de sustrato y estimar los valores de velocidad máxima (Vmax), constante catalítica (kcat) y constante de Michaelis-Menten (KM) de la fosfatasa alcalina con el fenilfosfato. Reactivos y procedimientos: según Guía de Trabajos Prácticos “Cinética Enzimática”, págs. 20-22. Resultados: Tabla 1: Datos de Absorbancia a 710 nm y Cantidad de fosfato de los tubos 1 al 6 (tubos patrón). n° de tubo Cantidad de Pi (μmol) Abs 710 nm 1 0 0, 2 0,2 0, 3 0,4 0, 4 0,6 0, 5 0,8 0, 6 1,0 0, Gráfico 1: Curva de calibración Abs710 nm = f (μmoles Pi). 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.
f(x) = 0.66 x + 0.
R² = 0.
Curva de Calibración: Abs a 710 nm = f (cantidad de Pi) Cantidad de Pi (umol) Abs a 710 nm
Tabla 2: cantidad de producto (Pi) generado en los tubos de reacción, obtenidos a partir de la ecuación de la curva de calibración. n° de tubo Cantidad de Pi (μmol) Abs 710 nm 7 0 0, 8 0 0, 9 0 0, 10 0,27 0, 11 0,35 0, 12 0,42 0, 13 0,46 0, 14 0,55 0, 15 0,61 0, 16 0,63 0, 17 0,65 0, Controles (tubos 7,8 y 9): Valores de Pi despreciables por ser negativos y muy bajo por lo tanto no se necesita corregir. Tabla 3: Velocidad Inicial (Vi) obtenida como la cantidad de producto formado/tiempo de reacción, concentración de sustrato y cantidad de Pi para los tubos de reacción. Concentración de enzima en el medio de reacción: 10 μg/ml Tiempo de reacción: 5 min n° de tubo Cantidad de Pi (μmol) Vi (μmol/min) Solución de Sustrato (mM) 10 0,27 0,054 1 11 0,35 0,070 1, 12 0,42 0,084 2 13 0,46 0,092 2, 14 0,55 0,110 4 15 0,61 0,122 6 16 0,63 0,126 8 17 0,65 0,130 10 Tabla 4: Valores de la inversa de la concentración de sustrato y la inversa de la velocidad inicial (Vi) para los tubos de reacción. n° de tubo 1/ [S] (mM -1) 1/Vi (min/μmol) 10 1 18, 11 0,714 14, 12 0,5 11, 13 0,357 10, 14 0,25 9, 15 0,167 8, 16 0,125 7, 17 0,1 7,
Cálculos realizados: Tabla 2: Ecuación de la recta: Abs a 710 nm = 0,6632 μmol -1^ x cantidad de Pi (μmol) + 0, Controles (tubos 7,8 y 9): Tubo 7: Cantidad de Pi (μmol) = (0,068 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = -2,26 x 10 -3^ μmol Tubo 8: Cantidad de Pi (μmol) = (0,070 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 7,54 x 10 -4^ μmol Tubo 9: Cantidad de Pi (μmol) = (0,069 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = -7,54 x 10 -4^ μmol Tubos de reacción (10 al 17): Tubo 10: Cantidad de Pi (μmol) = (0,251 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 11: Cantidad de Pi (μmol) = (0,302 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 12: Cantidad de Pi (μmol) = (0,349 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 13: Cantidad de Pi (μmol) = (0,375– 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 14: Cantidad de Pi (μmol) = (0,435 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 15: Cantidad de Pi (μmol) = (0,476– 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 16: Cantidad de Pi (μmol) = (0,488 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tubo 17: Cantidad de Pi (μmol) = (0,498 – 0,0695) / 0,6632 μmol -1^ = 0, μmol Tabla 4: Transformación de las dobles recíprocas. 1/ [S] (mM -1) 1/1 = 1 mM - 1/1,4 = 0,714 mM - ½ = 0,5 mM - 1/2,8 = 0,357 mM - ¼ = 0,25 mM - 1/6 = 0,167 mM -
1/8 = 0,125 mM - 1/10 = 0,1 mM - 1/Vi (min/μmol) 1/0,054 = 18,52 min/μmol 1/0,070 = 14,29 min/μmol 1/0,084 = 11,90 min/μmol 1/0,092 = 10,87 min/μmol 1/110 = 9,09 min/μmol 1/122 = 8,20 min/μmol 1/126 = 7,94 min/μmol 1/130 = 7,69 min/μmol Cálculo de Kcat: [E] = 10 μg/ml o 0,01 mg/ml 160.000 mg -------- 1 mmol 0,01 mg --------------- x = 6,25 x 10 -8^ mmol/ml V máx. = 0,155 μmol/min o 1,55 x 10 -4^ mmol/min Entonces, Kcat = Vmax/ [E] = 1,55 x 10-4^ mmol/min /6,25 x 10-8^ = 2480 min
Conclusión/Interpretación de resultados/Discusión: Se determinó la Velocidad de hidrólisis del fenilfosfato por la fosfatasa alcalina en función de la concentración de sustrato agregado, en condiciones de estado estacionario, con una concentración fija de Enzima en el medio de reacción de 10 μg/ml y un tiempo de reacción de 5 minutos. Se verifica la relación lineal existente entre la inversa de la Vi en función de la inversa de la concentración de sustrato mediante la transformación de las dobles recíprocas, es decir los puntos ajustan a una recta, entonces los puntos obtenidos experimentalmente de Vi y concentración de sustrato pueden describirse por la ecuación de una hipérbola rectangular.
