Baixe Acidos Nucleicos e outras Notas de estudo em PDF para Engenharia Agronômica, somente na Docsity!
9. BASES QUÍMICAS DA HERANÇA
Uma das mais belas histórias sobre as descobertas científicas humanas é a que descreve o desenvolvimento da genética molecular, a qual continua e deverá continuar sendo escrita. Ao longo de quase 100 anos, os fatores mendelianos, ou as unidades determinantes das características dos organismos, tiveram sua localização, composição e função esclarecidas. Muito já se descobriu sobre como os genes são regulados, embora muito mais ainda deva ser descoberto. O mesmo pode ser dito em relação a processos como replicação de ácidos nucléicos, transcrição e tradução, a serem posteriormente abordados. Felizmente, todos os esforços humanos e a enorme quantidade de recursos despendidos foram extremamente válidos, em razão dos inúmeros benefícios garantidos à sociedade. Entre estes podemos citar a compreensão das causas de uma série de doenças humanas, facilitando o planejamento de tratamento para a cura, e o desenvolvimento de vegetais e animais com modificações genéticas planejadas, úteis na obtenção de remédios, alimentos de melhor qualidade e, mais recentemente, órgãos necessários à sobrevivência de indivíduos com problemas cardíacos, entre outros. A descoberta da localização dos genes ocorreu no início do desenvolvimento da genética, com o estabelecimento da Teoria Cromossômica da Herança. Comparativamente a outras descobertas, esta ocorreu relativamente cedo e sem polêmica. O mesmo não aconteceu com a descoberta da composição dos genes. Como os cromossomos são compostos por DNA e proteínas, durante muitos anos duas correntes de pensamento existiram: (1) a informação necessária à vida estaria nas proteínas nucleares e (2) os genes seriam segmentos de ácidos nucléicos. Somente em 1944 foi obtida a primeira evidência de que os genes seriam segmentos de DNA. Em seu trabalho com a bactéria Diplococcus pneumoniae , Avery, MacLeod e McCarty obtiveram evidência que a informação necessária à síntese da cápsula das cepas virulentas está na molécula de DNA deste procarioto. Evidência suplementar foi obtida por Hershey e Chase, em 1952. No trabalho destes cientistas ficou evidenciado que as informações necessárias à replicação do vírus T2, um bacteriófago de Escherichia coli , e à síntese de seu capsídeo estão no DNA viral. Em 1957, Fraenkel- Conrat e Singer demonstraram que os genes do vírus do mosaico do fumo (TMV) são segmentos de RNA. Estes e muitos outros resultados permitiram o completo esclarecimento sobre a composição química dos genes de eucariotos, procariotos e vírus. Os genes de eucariotos e procariotos são segmentos de DNA. Em relação aos vírus, seu material genético é também ácido nucléico, DNA ou RNA, dependendo do vírus. Em relação a muitos vírus o material genético é DNA dupla hélice, como o de eucariotos e procariotos. Para inúmeros outros o material genético é DNA fita simples. Há, contudo, vírus cujo material genético é RNA fita simples. Os demais têm como material genético uma molécula de RNA dupla hélice. Os genes do vírus HIV, provavelmente o mais conhecido de nossa sociedade, são segmentos de RNA fita simples. Ainda na década de 50, mais precisamente em 1953, Watson e Crick apresentaram um modelo de estrutura tridimensional do DNA presente em eucariotos e procariotos, sugerindo também como seria o processo de replicação da molécula de DNA dupla hélice. A hipótese de replicação semi-conservativa sugerida foi comprovada cinco anos depois, por Meselson e Stahl. No que diz respeito à expressão gênica, é interessante ressaltar que as primeiras idéias, sem confirmação experimental, foram apresentadas por um médico de nome Garrot, na primeira década do nosso século. Em seu livro sobre algumas doenças humanas, a leitura do título é suficiente para esclarecer a forma como ele compreendia as causas das mesmas: erros no metabolismo celular. Logo, considerando a sugestão deste médico, se uma doença é determinada por um gene recessivo, a causa da anormalidade seria a incapacidade do organismo afetado produzir uma determinada substância, provavelmente por que o gene responsável pela mesma ou não é capaz, de alguma maneira, de determinar a síntese do produto ausente ou direciona a síntese de um produto alterado, sem funcionalidade. Um trabalho pioneiro nesta área, no qual os autores, Beadle e Tatum, combinaram genética mendeliana e bioquímica, foi publicado em 1941. Neste ficou evidenciado, a partir de experimentos com o fungo ascomiceto Neurospora crassa ,
que os genes são responsáveis pela síntese das enzimas que garantem o normal metabolismo celular e, portanto, a vida dos organismos. Avanços formidáveis no conhecimento sobre regulação dos genes, sobre como os genes direcionam a síntese de seus produtos, no esclarecimento do código genético, sobre a transferência de genes de um organismo para outro, sobre o seqüenciamento (identificação da seqüência de bases) de genes, entre muitos outros aspectos, foram obtidos a partir da década de sessenta.
9.1.. Composição Química dos Ácidos Nucléicos e Estrutura do Ácido Desoxirribonucléico (DNA) de
Eucariotos e Procariotos Os ácidos nucléicos (DNA e RNA) são moléculas compostas por sub-unidades denominadas nucleotídeos (desoxirribonucleotídeos no DNA e ribonucleotídeos no RNA). Cada nucleotídeo é composto por: uma molécula de açúcar com cinco carbonos (pentose); a pentose no DNA é a 2-desoxirribose (sem grupamento hidroxil (OH) ligado ao carbono 2’) (); a pentose no RNA é a ribose (com grupamento hidroxil ligado ao carbono 2’) (); uma base nitrogenada ligada ao carbono 1’ da pentose; as bases normalmente encontradas no DNA são adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C) (); as comumente encontradas no RNA são adenina, guanina, uracil (U) e citosina (); adenina e guanina são bases púricas ou purinas (com dois anéis cíclicos); timina, uracil e citosina são bases pirimídicas ou pirimidinas (com um anel cíclico); a adenina tem um grupamento amino (NH 2 ); a guanina possui um grupamento amino e um grupamento ceto (C=O); timina e uracil têm dois grupamentos ceto (a timina apresenta um grupamento metil (CH 3 ) e a uracil não o possui); a citosina tem um grupamento amino e um ceto; um grupamento fosfato (PO 4 2-) ligado ao carbono 5’ da pentose ( e ). É importante salientar que ao carbono 3’ da pentose de cada nucleotídeo está ligado um grupamento hidroxil. As posições denominadas 3’ e 5’ de cada nucleotídeo são importantes na caracterização da polaridade de uma fita de nucleotídeos.
O antiparalelismo das duas fitas de nucleotídeos pode ser percebido na. Nesta está apresentado um pequeno fragmento de uma molécula de DNA, com quatro pares de nucleotídeos, completos. A fita à esquerda tem na extremidade superior um grupamento fosfato, caracterizando sua extremidade 5’. Na extremidade inferior da mesma fita está o oxigênio ou o grupamento hidroxil ligado ao carbono 3’, caracterizando sua extremidade 3’. Se diz que a polaridade desta fita, de cima para baixo, é 5’ para 3’. Ao contrário, a fita oposta, à direita, tem na extremidade superior o oxigênio ligado ao carbono 3’ e na extremidade inferior o grupamento fosfato do último nucleotídeo representado. Sua polaridade é, então, também de cima para baixo, 3’ para 5’. Portanto, as duas fitas de nucleotídeos têm polaridade oposta. O antiparalelismo é obrigatório para que as duas fitas se associem, formando a estrutura helicoidal.
Figura - Ilustração de uma molécula de DNA dupla hélice, de acordo com o modelo de Watson e Crick (os círculos amarelo, cinza, vermelho e branco definem as duas fitas de açúcar e fosfato; os azuis definem as bases nitrogenadas).
Figura - Representação no plano da molécula de DNA de eucariotos e procariotos.
Uma vez conhecida a propriedade de complementaridade de bases é imediato concluir que nos eucariotos, procariotos e vírus de DNA dupla hélice, o quociente entre a quantidade de bases púricas (A + G) e a quantidade de bases pirimídicas (T + C) é igual a 1, pois para cada molécula de adenina existe uma de timina, o mesmo sendo verdadeiro em relação às bases guanina e citosina. Nos vírus de RNA dupla hélice, cuja estrutura tridimensional é idêntica à descrita para o DNA, a relação (A + G)/(U + C) é também igual a 1. Contudo, não é possível estabelecer um valor para as relações descritas, quando se considera os vírus de DNA e RNA fita simples. Mesmo que haja a formação de muitas pontes de hidrogênio entre bases complementares localizadas em regiões distintas da mesma fita, a quantidade de bases púricas não terá, obrigatoriamente, relação com a quantidade de pirimidinas.
Replicação de Molécula de DNA A replicação de uma molécula de DNA dupla hélice é semi-conservativa, pois durante o processo cada fita de desoxirribonucleotídeos serve de molde para a síntese de uma fita complementar. Logo, nas duas moléculas resultantes, denominadas filhas, apenas uma fita é recém-sintetizada. A outra é da molécula que se replicou (). Perceba na que o nucleotídeo da extremidade 5’ de cada fita tem grupamento trifosfatado ligado ao carbono 5’ da pentose. É um processo que envolve a participação de muitas enzimas e proteínas. Como já visto, ocorre durante a fase S da intérfase. Nos eucariotos a replicação se inicia em vários pontos ao longo da molécula e é bidirecional, ou seja, em cada sítio de replicação há síntese de DNA nas duas possíveis direções (). Em Escherichia coli , a replicação se inicia em um único local de seu DNA circular e também é bidirecional. A replicação unidirecional é encontrada em alguns vírus.
Figura - Ilustração diagramática da replicação de uma molécula de DNA, mostrando que nas duas moléculas filhas apenas uma das fitas de nucleotídeos é recém sintetizada.
Figura - Ilustração de um fragmento de uma molécula de DNA, no qual existem dois sítios de replicação (as setas indicam a direção de replicação e os fragmentos em vermelho correspondem a DNA recém sintetizado).
Antes de haver síntese de DNA ocorre a síntese de um pequeno fragmento de RNA, denominado RNA iniciador ou ‘primer’, pela enzima primase, na direção 5’ para 3’. Em geral, nos eucariotos o ‘primer’ tem cerca de 10 nucleotídeos, enquanto nos procariotos é formado por cerca de 10 a 60 nucleotídeos. Não apenas a primase, mas todas as enzimas que polimerizam ácido nucléico atuam na direção 5’ para 3’. Isto significa que cada novo nucleotídeo é inserido na extremidade 3’ da fita que está sendo sintetizada, uma vez que as polimerases só são capazes de estabelecer ligação fosfodiéster entre grupamento OH livre, ligado ao carbono 3’ da pentose do nucleotídeo na extremidade 3’ da fita, e o grupamento trifosfatado do nucleosídeo (pentose + base + grupamento trifosfatado) que está sendo inserido. Portanto,
Devido à complementaridade entre base da fita molde de DNA e base do desoxirribonucleosídeo a ser inserido no DNA em síntese, as duas moléculas filhas são iguais à molécula que se replicou, ou seja, têm exatamente a mesma seqüência de pares de nucleotídeos (). Em relação a um cromossomo de eucarioto, é importante enfatizar que ao longo do processo de replicação, as estruturas da fibra de 110 angstrons e da molécula DNA são provisoriamente desfeitas. Contudo, imediatamente após a replicação os fragmentos das moléculas filhas voltam a se organizar como fibra nucleossômica de 110 Å, originando as duas cromátides que compõem um cromossomo duplicado (). Logo, a duplicação de um cromossomo é conseqüência da replicação de sua molécula de DNA. E ainda, as cromátides irmãs têm a mesma seqüência de genes, ou seja, são geneticamente iguais, porque cada uma têm uma das moléculas filhas resultante da replicação.
Figura - Síntese de DNA em uma forquilha de replicação, gerando duas moléculas filhas
Figura - Esquema mostrando que as moléculas filhas têm a mesma seqüência de nucleotídeos que a molécula que se replicou e, portanto, os mesmos genes (para ilustração estão representados alguns dos nucleotídeos de um gene qualquer A).
9.3.. Transcrição
Para que um gene direcione a síntese de seu produto, é necessário que ele seja transcrito. O fenômeno de transcrição, em eucariotos e procariotos, pode ser assim definido: Síntese de molécula de RNA, cuja seqüência de nucleotídeos é determinada pela seqüência de desoxirribonucleotídeos da fita codante do gene.
A síntese de RNA é feita por uma enzima denominada RNA polimerase, na direção 5’ para 3’. Em E. coli há apenas uma RNA polimerase descrita. Em eucariotos, pelo menos três já foram descritas. Uma transcreve os genes estruturais, a outra os genes para rRNA e a terceira transcreve os genes para tRNA. Como a primase, e de forma diferente de toda DNA polimerase, as RNA polimerases não necessitam de uma hidroxila livre para promover polimerização, mas apenas de uma fita molde. Durante a transcrição de um gene, apenas uma das fitas de nucleotídeos serve sempre de molde para a síntese de RNA (). Aqui ela será tratada por fita codante. Este fato garante que cada gene direciona a síntese de um único produto (lembre-se que as duas fitas de nucleotídeos são complementares e não idênticas). Isto não significa dizer que a fita codante dos genes em uma mesma molécula de DNA seja obrigatoriamente a mesma. Observe na que a molécula de RNA em síntese é complementar e tem polaridade oposta em relação à fita codante do gene. Portanto, é fácil entender qual a informação presente em uma gene: é a sua seqüência de pares de nucleotídeos ou, no caso dos vírus de DNA ou RNA fita simples, sua seqüência de nucleotídeos. Como será visto, ela determina a seqüência de nucleotídeos em um rRNA ou tRNA ou a seqüência de aminoácidos em um polipeptídeo. Em eucariotos a transcrição leva, em geral, à síntese de moléculas precursoras de mRNA (RNA mensageiro), o qual é produto da transcrição de gene estrutural, rRNA e tRNA, as quais são posteriormente processadas.
Figura - Representação do processo de transcrição de um gene.
Um dos eventos que podem ocorrer durante o processamento pós-transcricional de moléculas precursoras de mRNA, rRNA e tRNA, é a remoção dos introns (). Os genes dos eucariotos são em geral intercalados por seqüências de pares de nucleotídeos que não codificam para o produto do gene, denominadas introns. As seqüências de pares de nucleotídeos que determinam o produto de gene são denominadas de exons. Quando um gene formado por introns e exons é transcrito, toda a seqüência de nucleotídeos da fita codante é usada como molde pela RNA polimerase. Portanto, na molécula de RNA sintetizada há seqüências complementares aos nucleotídeos de introns e exons do gene. Logo, a molécula de RNA também é formada por introns e exons. Os introns nas moléculas precursoras de mRNA, rRNA e tRNA, podem ser definidos como seqüências de nucleotídeos que não permanecem após o processamento. Em conseqüência, em geral as moléculas de mRNA, rRNA e tRNA são formadas apenas por exons. A remoção dos introns envolve quebras de ligações fosfodiéster e posterior reunião dos exons, devido à formação de novas ligações fosfodiéster. Nos eucariotos então, para que um gene para rRNA ou um gene para tRNA direcione a síntese de seu produto é necessário que haja transcrição e, quando o mesmo apresenta seqüências não codantes, remoção dos introns da molécula precursora de rRNA ou tRNA. Em relação às moléculas precursoras de mRNA, os seguintes eventos podem também ocorrer após transcrição:
- adição de um grupamento 7-metil-guanosina, um ribonucleotídeo de guanina metilada, denominado CAP, à extremidade 5’ da molécula ();
- adição de cerca de 200 ribonucleotídeos de adenina denominada cauda poliadenilada ou cauda poli-A, `a extremidade 3’ da molécula, pela enzima poli-A polimerase, na direção 5’ para 3’ ();
UUC - phe UCC - ser UAC - tyr UGC - cys C UUA - leu UCA - ser UAA - ochre UGA - opal A UUG - leu UCG - ser UAG - amber UGG - trp G C CUU - leu CCU - pro CAU - his CGU - arg U CUC - leu CCC - pro CAC - his CGC - arg C CUA - leu CCA - pro CAA - gln CGA - arg A CUG - leu CCG - pro CAG - gln CGG - arg G A AUU - ile ACU - thr AAU - asn AGU - ser U AUC - ile ACC - thr AAC - asn AGC - ser C AUA - ile ACA - thr AAA - lys AGA - arg A AUG - met ACG - thr AAG - lys AGG - arg G G GUU - val GCU - ala GAU - asp GGU - gly U GUC - val GCC - ala GAC - asp GGC - gly C GUA - val GCA - ala GAA - glu GGA - gly A GUG - val GCG - ala GAG - glu GGG - gly G
Antes de descrevermos como os ribossomos constróem um polipeptídeo, discutiremos sobre a atividade de transporte de aminoácidos pelas moléculas de tRNA. Para participar da síntese de polipeptídeos as moléculas de tRNA são previamente ligadas com seu aminoácido específico, formando os aminoacil-tRNA. Um aminoacil-tRNA é uma molécula de tRNA ligada covalentemente com um aminoácido. Sua formação ocorre pela atividade de enzima denominada aminoacil-tRNA sintetase. Como existem 20 aminoácidos que compõem as nossas proteínas, devem existir o mesmo número destas sintetases. A atividade de uma destas enzimas está representada na. Inicialmente ocorre a ativação do aminoácido, ou seja, sua ligação com adenosina monofosfato (AMP). Em seguida, há a formação de ligação covalente entre o grupamento OH livre da molécula de tRNA e o grupamento carboxílico do aminoácido, formando o aminoacil-tRNA. A forma em L invertido de uma molécula de tRNA é o resultado da formação de pontes de hidrogênio entre bases de diferentes partes da molécula. Uma de suas características é apresentar três a quatro alças, dependendo da molécula, em uma das quais, localiza-se o anticódon. Anticódon é uma seqüência de três nucleotídeos (três bases nitrogenadas) em molécula de tRNA, que se associa a um dado códon no mRNA, durante tradução, devido à complementaridade de suas bases. A síntese de um polipeptídeo começa com a associação da sub-unidade menor do ribossomo e do metionil tRNA ini^ (aminoacil-tRNA de metionina iniciador) com a molécula de mRNA (a). Só em seguida ocorre a associação da sub-unidade maior, formando o ribossomo. Nesta fase há participação de algumas proteínas, denominadas fatores protéicos de iniciação. É interessante ressaltar que o aminoacil que reconhece o códon de iniciação não é o mesmo que se associa com o mRNA em resposta a um códon AUG interno.
Figura - Representação das atividades de uma aminoacil-tRNA sintetase, no processo de formação do aminoacil tRNA do aminoácido X. Uma vez formado o ribossomo, o metionil-tRNA ini^ e o códon de iniciação ocupam um de seus sítios, denominado sítio peptidil ou P. O outro sítio, chamado sítio aminoacil ou A, contém o segundo códon (5’ GCC 3’, na ilustração) (b). A entrada de um aminoacil-tRNA no sítio A depende da existência de um com anticódon complementar ao códon localizado neste sítio. Não sendo um códon de terminação, entrará no sítio A um aminoacil-tRNA, daí o nome do sítio.
Figura - Esquema descrevendo a síntese de uma cadeia polipeptídica: (a) associação da sub-unidade menor do ribossomo e do aminoacil-tRNA iniciador com o mRNA; (b) associação da sub-unidade maior, formando o ribossomo; (c) entrada de um aminoacil no sítio A; (d)atividade de transferase da sub-unidade maior, estabelecendo ligação peptídica entre o grupamento carboxílico da metionina e o grupamento do segundo aminoácido, produzindo um dipeptídeo; (e) retirada do tRNA de metionina e deslocamento do ribossomo; (f)entrada de um novo aminoacil-tRNA no sítio A; (g) entrada de fator protéico de liberação no sítio A, ocasionando o término da síntese; (h) liberação do polipeptídeo.
Na ilustração, a presença do códon 5’ GCC 3’ determinou a entrada do alanil-tRNA ala^ no sítio A (c). Em seguida, a sub-unidade maior realiza a função de transferase, estabelecendo ligação peptídica entre o grupamento carboxílico da metionina e o grupamento amino do aminoácido ligado ao tRNA no sítio A, formando o dipeptídeo metionina - segundo aminoácido (alanina na ilustração). Observe na d que a metionina é transferida para o aminoacil no sítio A, originando um peptidil (peptídeo ligado a molécula de tRNA). A fase seguinte envolve a retirada do tRNA de metionina do sítio P e o deslocamento do ribossomo na direção 5’ para 3’ (e). Tais atividades requerem a participação dos fatores protéicos de elongação. O deslocamento do ribossomo se completa quando o segundo códon e o peptidil a ele associado passam a ocupar o sítio P, daí o seu nome (terceira ilustração da e). Em conseqüência, o terceiro códon entra no sítio A, determinando a entrada de novo aminoacil, com anticódon complementar (seril-tRNA ser^ no esquema da f). Evidentemente, a atividade de transferase da sub-unidade maior irá ligar o grupamento carboxílico do dipeptídeo metionina - segundo aminoácido com o grupamento amino do terceiro aminoácido, originando o tripeptídeo metionina - segundo aminoácido - terceiro aminoácido (metionina - alanina - serina no esquema apresentado), ligado ao tRNA do terceiro aminoácido. Em seguida haverá novo deslocamento do ribossomo, correspondente a três nucleotídeos, na direção 5’ para 3’. Perceba que após a formação do dipeptídeo, a atividade de transferase da maior sub-unidade do
