Aulas Práticas de Microbiologia, Notas de aula de Odontologia

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NORMAS DE SEGURANÇA NO TRABALHO NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas práticas de Microbiologia têm como objetivo ensinar ao acadêmico os princípios gerais e métodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactérias, sendo algumas patogênicas para o homem, portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminações acidentais.

• O uso do guarda-pó é obrigatório.
• Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interferir com reagentes e equipamentos.
• Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática.
• Lavar e sanificar as mãos ao iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário. Se for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material.
• Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise.
• Utilizar exclusivamente material estéril para a análise.
• No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfecção e esterilização. O mesmo procedimento deverá ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes.
• Não comer, beber ou fumar no laboratório.
• Manter canetas, dedos e outros longe da boca.
• Não utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.
• Avisar ao professor em caso de contaminação acidental.
• Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-os sobre a bancada.
• Flambar as alças, agulhas e pinças antes e após o uso.
• Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados, portanto não os colocar na estufa ou despejar na pia.
• Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se não há vazamento de gás ou substâncias inflamáveis por perto.
• (^) Trabalhe sempre próximo ao fogo.

OBS: A utilização do Bico de Bunsen é essencial pois visa a diminuição de microrganismos no campo de trabalho através do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possível selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e não forma fuligem. É importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato é importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, já que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama são: Zona Neutra (é uma zona fria e, portanto, não deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (são zonas onde já ocorre a combustão e, portanto, já podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 1

• A colocação do material deve permitir a circulação do ar, portanto a estufa não pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distância de 2 cm entre as caixas.
• O tempo de esterilização deve ser contado apenas após a colocação do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente. I.2- Esterilização pelo Calor Úmido

O calor úmido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais através das formas de: vapor d’água, água fervente e água aquecida abaixo de seu ponto de ebulição.

• Água fervente É a água levada ao ponto de ebulição: 100ºC, este procedimento destrói os microrganismos vegetativos presentes no meio líquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados não são esterilizados com segurança pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100ºC por mais de 1 hora.
• Vapor d’água O vapor d’água sob pressão é a mais prática e segura aplicação do calor úmido. O aparelho destinado a este fim é a AUTOCLAVE. É um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavação é feita a 121º C com tempo de exposição de 15 a 30 minutos. A penetração do vapor no material garante maior nível de destruição dos microrganismos, e por este motivo é mais rápido. Funcionamento da autoclave:

1. A câmara de parede dupla da autoclave é lavada com vapor fluente para remover todo o ar;

2. É então preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e pressão por um período

específico de tempo. É essencial que todo o ar residual inicialmente presente na câmara seja completamente substituído por vapor d’água, porque se o ar estiver presente reduzirá a temperatura interna da autoclave;

3. A autoclave é usualmente operada a uma pressão de 15 lb./pol² , na qual a temperatura do vapor é de 121ºC.

A eficiência do processo de esterilização depende de alguns fatores:

✓ Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados.

✓ O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121ºC é atingida.

✓ A distribuição do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual.

✓ Se o material sair úmido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.

Controle da Esterilização

É imprescindível o controle de qualidade nos processos de esterilização. Como se trata de um processo que inclui diversas variáveis (tempo, temperatura, limpeza prévia, conhecimento da pessoa responsável pelo processo, etc), se qualquer destas variáveis for negligenciada, o processo não será efetivo e o risco de contaminação é eminente. O controle deve ser realizado através de métodos químicos e bacteriológicos. Os métodos químicos utilizam uma fita especial que mostra, através da mudança de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os métodos bacteriológicos utilizam a bactéria chamada Bacillus subtilis , que por ser produtora de esporos, é uma eficiente indicadora da qualidade do processo. Este controle deve fazer parte da rotina do consultório para garantir a saúde dos pacientes e de toda a equipe.

Considerações importantes

1. É importante lembrar que é necessária uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de serem submetidos à

esterilização. A presença de matéria orgânica (óleo, gordura, pus, sangue, e outras secreções) protege o microrganismo da ação esterilizante. É adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e água morna antes da esterilização.

2. Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrário

voltam a se recontaminar com microrganismos presentes no ambiente.

3. Estudos recentes mostraram que os termômetros e termostatos embutidos na estufas em consultórios

odontológicos não são confiáveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termômetros calibrados de acordo com as especificações do INMETRO. Se não for possível, deve-se considerar que o termômetro de mercúrio tem uma incerteza na medição da faixa de 5ºC a 10ºC.

4. Deve-se realizar o controle periódico da qualidade do processo, através de profissionais preparados para tal

procedimento.

II- DESINFECÇÃO

Este processo pode ser realizado de forma física (Pasteurização) e química (Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfecção de alto, intermediário ou de baixo nível, dependendo da quantidade de microrganismos inativados.

1. Desinfecção de alto nível: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M.

tuberculosis. Este tipo de desinfecção é indicado para itens classificados como “semi-críticos”, ou seja, que entram em contato com mucosas íntegras e pele não íntegra (p. ex. abridor de boca, condensadores de amálgama, espátulas para inserção de resinas, etc.)

2. Desinfecção de nível intermediário: é aquela que inativa bactérias na forma vegetativa ( M. tuberculosis ),

fungos e a maioria dos vírus. É indicada para uso em itens classificados como “não-críticos”, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele íntegra. (p. ex. estetoscópios, termômetros, esfigmomanômetros, gorro, máscara, refletor, etc.)

3. Desinfecção de baixo nível: inativa a maioria das bactérias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis ,

alguns fungos e vírus. É indicada também para itens de uso “não-crítico”.

II.1- Desinfecção por agentes físicos:

• Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulição (100º C) Pasteurização: é o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as células vegetativas de microrganismos, mas não os esporos, portanto, é um método de desinfecção de alto nível. É indicado o uso de temperatura de 77ºC por 30 minutos.

II.2- Desinfecção por agentes químicos:

11.2.a) Método de Desinfecção de alto nível:

• Glutaraldeído : é indicado qualquer objeto sensível ao calor, e para rápida desinfecção de itens reutilizados. É utilizado em solução a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos.
• Formaldeído: Pode ser encontrado na forma sólida (pastilhas formalina) ou como solução aquosa 37-40% (diluído em álcool ou água). A solução deve ser usada por30 minutos sendo a concentração de 8% em solução alcoólica e 10% em solução aquosa.
• Peróxido de Hidrogênio: Age em presença de matéria orgânica e deve-se fazer a imersão do material em solução com concentração de 3-6% por 15-30 minutos.
• Ácido Peracético: A concentração de uso é variável para a desinfecção, sendo que o tempo de exposição deve ser no mínimo de 20 minutos.

11.2.b) Método de Desinfecção de nível intermediário:

Fenóis Gram-positivas

Gram-negativas

BAAR

Desinfectantes Desnaturação

protéica

Efeito imediato Fenol puro é

corrosivo e de odor

desagradável

Compostos

Quaternários de

amônio

Gram-positivas

Gram-negativas

Antissépticos

Sanitizantes

Desinfectantes

(instrumentos

cirúrgicos)

Alteração da

membrana

celular

bacteriana

Curto (10-

min)

Não age sobre

BAAR e esporos

Cloro Gram-positivas

Gram-negativas

BAAR

Tratamento da

água

Inativação

enzimática

agente oxidante

Efeito imediato Odor irritante pouco

ativo contra esporos

Iodo Gram-positivas

Gram-negativas

BAAR

Antissépticos

Desinfectantes

Inativação

enzimática

Efeito imediato Odor irritante pouco

ativo contra esporos

Iodóforos Gram-positivas

Gram-negativas

BAAR

Antissépticos

Desinfectantes

Inativação

enzimática

Efeito imediato Pouco ativo contra

esporos

Aldeídos*** Gram-positivas

Gram-negativas

BAAR

Desinfectantes

(instrumentos e

superfícies)

Desnaturação

protéica agente

alquilante

Curto (formas

vegetativas)

Prolongado

(esporos)

Tempo de exposição

longo

Metais pesados Gram-positivas

Gram-negativas

Antissépticos Inativação

enzimática

Só agem

enquanto em

contato

Não atuam sobre

BAAR e esporos

*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. **- Bacilos álcool-ácido resistentes; ***- Ativos contra esporos Técnica I : O experimento que será realizado tem por objetivo verificar a ação de antissépticos sobre a microbiota das mãos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:

1- Pegar uma placa de Petri contendo ágar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a divisão na parte de baixo da placa.

2- Identificar cada quadrante com os respectivos títulos: Controle ( C ), Mão Suja ( MS ), Detergente ( Det ), Álcool 70% ( A ), e Álcool Iodado ( AI ). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo.

3- No quadrante identificado como “ Mão Suja” o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no ágar por 1 minuto. 4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mãos com detergente, secá-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “Detergente” por 1 minuto. 5- O mesmo aluno deve então lavar as mãos com álcool, secá-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do ágar identificado como “álcool” por 1 minuto. 6- A placa deve ser levada para incubação.

OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como “Controle”.

Técnica II : Este procedimento tem por finalidade observar a efetividade do processo de esterilização por autoclave, através da comparação entre material contaminado levado para o processo de esterilização e aquele que não passa por esse processo.

1- Retire um fio de cabelo (ou um pedaço de unha), e divida o material em duas partes. 2- Coloque uma parte do material em cada tubo de ensaio. 3- Identifique os tubos, destinando um para a autoclave ( A ) e o outro para a estufa ( E ). 4- O tubo E deve ser imediatamente incubado. 5- O tubo A deve ser encaminhado a autoclave, sendo a seguir também incubado (pela equipe de técnicos do departamento).

Aula Prática III: Microscopia a Fresco

Sabemos que as bactérias são seres microscópicos, portanto a sua observação direta depende do uso do microscópio. Essa observação pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem coloração. A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactérias e atividades celulares como a motilidade bacteriana. A respeito da motilidade é possível observar dois movimentos: o movimento flagelar, que é ativo e característico de bactérias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual é passivo e ocorre na direção das correntes líquidas que se formam nas preparações.

Técnica: Será utilizada a técnica denominada Gota Pendente, na qual o inóculo fica suspenso em uma lâmina escavada (lâmina de Koch).

1. Retire com uma alça esterilizada uma gotícula da cultura-teste.

2. Deposite esta gotícula no centro de uma lamínula previamente limpa e seca.

3. Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lâmina escavada, também limpa e seca.

4. Inverta a lâmina côncava sobre a lamínula de forma que a gotícula ocupe o centro da concavidade.

5. Inverta novamente a posição da lâmina, de forma que a gotícula fique pendente no centro da concavidade.

6. Leve a preparação ao microscópio e focalize a gota com objetiva de 40x com luz reduzida (as bactérias

possuem índice de refração próximo ao da água). Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O movimento flagelar é caracterizado pelo deslocamento, pela mudança da posição da bactéria, enquanto que o browniano não acarreta mudança na posição, não há deslocamento autônomo da bactéria.

F 0

2 0 Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula.

Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.

1. Desenhe o que foi visualizado na observação direta de microrganismos, exemplificando o movimento

observado.

2. Qual é a finalidade da utilização da técnica de gota pendente?

Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________

Aula Prática IV: Meios de Cultivo e Técnicas de Semeadura

• Meios inanimados: não possuem células vivas. Podem ser naturais ou sintéticos. Naturais são aqueles que possuem substâncias provenientes da natureza, e o sintético contém substâncias obtidas em laboratório. Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintéticos, que são resultantes da união dos dois anteriores.

Os meios de cultivo são preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade até o momento de sua utilização.

Técnica de Semeadura

A escolha da técnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porém algumas regras devem ser seguidas nas inoculações:

• A agulha e alça de níquel-cromo (também chamada de agulha e alça de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado de esfriá-las antes da coleta.
• Os recipientes devem sempre ser abertos próximos à chama do bico de Bunsen.
• Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.

Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio além de alterar as condições de crescimento bacteriano.

Técnica I : Meio Líquido

1. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

2. Mergulhe a alça carregada de bactérias no tubo com o meio de cultivo e agite a

alça.

Técnica II : Meio semi-sólido

1. Mergulhe a Agulha de níquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe é fornecida.

Figura 1Figura 2

Faça uma “injeção” com a agulha carregada com bactérias no meio de cultivo semi-sólido.

Técnica III : Meio sólido (ágar inclinado)

1. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

2. Encoste levemente a alça na parte mais baixa do plano

inclinado e suba fazendo estrias na superfície do ágar.

Técnica IV : Meio sólido (Placa de Petri – técnica do esgotamento)

1. Divida a Placa de Petri em três partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa.

2. Mergulhe a Alça de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe é apresentada.

3. Faça estrias em cada divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível toda a superfície da

placa.

Figura 3Figura 4

A parede celular de bactérias Gram-positivas difere-se das bactérias Gram-negativas pela presença de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausência de uma membrana externa. Esta diferença de constituição da parede celular é a base da coloração de Gram, uma técnica primordial no diagnóstico microbiológico, visto que através dela se definem características morfológicas e tintoriais da bactéria em pesquisa. A coloração de Gram consiste em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere coloração roxa tanto pelas bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas. Com a adição de álcool-acetona, as bactérias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano é de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retêm o complexo, permanecendo roxas. A adição de fuccina (ou safranina) não altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactérias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo álcool-acetona.

Técnica:

-Esfregaço da cultura bacteriana líquida:

1. Flambe uma alça, deixe esfriar, mantendo-a próximo a chama.

2. Retire uma amostra da cultura com a alça e deposite no centro da lâmina.

3. Espalhe o material com a alça em movimento circular, obtendo um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.

4. Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este

procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

-Esfregaço de cultura bacteriana sólida:

1. Flambe uma alça, deixa esfriar, mantendo-a próximo a chama.

2. Retire uma gota da água estéril e deposite sobre a lâmina.

3. Flambe novamente a alça, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura sólida.

4. Leve a amostra até a gota de água depositada sobre a lâmina, e homogeinize com movimentos circulares, para

obter um esfregaço de forma oval, uniforme e fino.

5. Fixe o esfregaço, passando a lâmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este

procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido.

• Adição de Corantes:

1. Coloque a lâmina com o esfregaço sobre um suporte.

2. Cubra a lâmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto.

3. Lave a lâmina em jato fraco de água corrente, do lado contrário ao esfregaço.

4. Cubra a lâmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lâmina.

5. Cubra a lâmina com a solução de álcool-acetona (Gram III), verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca

de 20 segundos.

6. Cubra a lâmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lâmina.

7. Seque inicialmente o lado da lâmina oposto ao esfregaço com papel toalha, e a seguir seque o restante da

lâmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse “cortando” a chama).

8. Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. (Não esqueça de colocar uma gota de óleo

para imersão sobre o esfregaço)

F 0

2 0 Para ajudar você a fixar o conteúdo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta aula.

Responda-as e entregue ao seu professor de laboratório.

1. Faça um desenho esquemático do que foi visualizado no microscópio, mostrando a morfologia

bacteriana e a reação tintorial.

2. Fale sobre o fundamento da técnica de Gram.

Nome do(a) acadêmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________

Aula Prática VI: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)

4. Pressione levemente os discos para que não se desprendam durante a incubação.

5. Incube as placas por 24 horas a 37°C.

Análise dos Resultados

Através da análise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: “resistente”, “intermediário”, “moderadamente sensível”, e “sensível”, dependendo da formação ou não de halo inibitório e também de seu diâmetro(Fig 4). No caso de formação de um halo inibitório, este deve ter seu diâmetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5). De modo geral, estas tabelas determinam medidas de diâmetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode então ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas.

FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade

Antimicrobiano Código [μg] Halos de Inibição (mm) Resistente Intermediário Moderadamente sensível

Sensível

Bacitracina BAC 10 < 8 9 a 12 - > 13 Cefotaxima CTX 30 < 14 - 15 a 22 > 23 Gentamicina GEN 10 < 12 13 a 14 - > 15 Tetraciclina TET 30 < 14 15 a 18 - > 19 Vancomicina VAN 30 < 9 10 a 11 - > 12

EXEMPLO : Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina, foi medido o diâmetro de um halo de inibição e constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado como sensível para a Gentamicina. Entretanto se o diâmetro do halo fosse de 13 mm o microrganismo seria classificado como intermediário a Gentamicina. No caso de não formação de um halo de inibição, o microrganismo seria considerado resistente.

Figura 4