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Curso de Interpretação de Exames Laboratoriais Módulo 06 Apostila
Tipologia: Notas de estudo
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Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este Programa de Educação Continuada, é proibida qualquer forma de comercialização do mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores descritos na Referência Consultada.
Microbiologia
1. Noções Gerais:
A análise microbiológica é de extrema importância na clínica e está diretamente relacionada com o diagnóstico/tratamento sendo na grande maioria das vezes o resultado de um exame microbiológico por si só suficiente, direcionando o clínico para o uso de um medicamento específico, como no caso de uma cultura/antibiograma. O laboratório de microbiologia tem a finalidade primordial de auxiliar no diagnóstico etiológico das doenças infecciosas causadas por microorganismos como bactérias e fungos. Para que isso ocorra de maneira satisfatória, a qualidade da coleta, do armazenamento e do transporte do material biológico é extremamente importante. Todos os materiais devem ser obtidos antes do início da terapia antimicrobiana. Devem ser colhidos no local onde se espera encontrar o microrganismo, e com a menor contaminação externa possível. Deve-se coletar amostra em quantidade suficiente, seguindo as instruções específicas para cada sítio. Antes de coletar o material, o local deve ser limpo com soro fisiológico, tomando-se o cuidado de não se utilizarem substâncias anti-sépticas.
Escherichia coli bactéria possibilitou enormes : O estudo dessa Fonte: www.cienciahoje.uol.com.bravanços à ciência O material colhido, salvo instruções específicas, deve ser acondicionado em recipiente estéril. Quanto mais precoce a coleta, maiores as chances de isolamento do agente etiológico. Os dados clínicos, assim como sítio e hora da coleta, são informações importantes para o tratamento adequado da amostra.
De forma geral o exame consiste em analisar a presença ou não de fungos no local da coleta, sendo um exame geral, não específico, uma vez que apenas estabelece as estruturas fúngicas presentes ou ausentes na amostra, descartando ou confirmando a infecção por fungos.
2.2 TINTA DA CHINA (TINTA NANQUIM):
Usado para pesquisa de criptococos em líquor ou outros materiais, permitindo destacar a cápsula deste fungo contra um fundo negro. O sedimento do líquor ou uma colônia do meio de cultura é suspensa em uma gota de tinta da China, fazendo um filme bem delgado entre lâmina e lamínula e observando em objetiva de 10X e 40X. Um erro comum é confundir linfócitos com criptococos. A diferenciação é feita através da observação do núcleo refringente e gemulação do fungo.
Criptococos em Líquor
A coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica é um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada. Não se pode deixar de destacar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil quando for corretamente realizada (do ponto de vista técnico) e interpretada por profissionais experientes. A coloração de Gram, desenvolvida em 1884 pelo médico dinamarquês Christian Gram, é um dos métodos de coloração mais (^) Fonte: www.britannica.comCocos Gram Positivos
aplicados em Bacteriologia. Trata-se de um método de coloração diferencial, dado que permite dividir as bactérias em duas classes - Gram negativas e Gram positivas. É pois uma ferramenta essencial na classificação e diferenciação de bactérias. A análise correta da Bacterioscopia por Gram é uma espécie de “divisor de águas”, uma vez que direciona a pesquisa para dois grandes grupos de bactérias, Gram Positivas (G+) e Gram Negativas (G-). A observação de microrganismos reveste-se de dificuldades não só devido à sua reduzida dimensão mas, também, porque estes são transparentes e praticamente incolores. Com o propósito de estudar as suas propriedades e/ou de diferenciar os microrganismos em grupos específicos para fins taxonômicos e de diagnóstico, recorre-se normalmente a técnicas de coloração. Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor lipídico, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lipídios elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática.
Diplococos Gram Negativos Intracelulares Fonte: www.escuela.med.puc.cl
Em conseqüência, durante o passo de diferenciação pelo álcool, parte dos lipídios são dissolvidas pelo álcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (violeta de cristal) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina). A parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lipídios é nulo ou muito baixo (em poucas espécies bacterianas). A camada de peptidoglicano atua, assim, como uma
O método de Ziehl-Neelsen baseia-se no fato da álcool-ácido resistência de determinadas bactérias (p. ex: Mycobacterium tuberculosis ), o que permite tratá-las com uma solução de fucsina fenicada a quente. Tais bactérias resistem ao tratamento posterior com uma solução de álcool+ ácido clorídrico (HCL 3% em etanol), mantendo-se com a coloração inicial vermelha (Bacilos Álcool-Ácido Resistentes ou BAAR), enquanto outras descoram-se e vão apresentar a coloração de fundo, normalmente feita com azul de metileno. Procedimento da coloração: Em lâmina nova, fazer um esfregaço homogêneo, delgado e fixado ao ar livre (recomenda-se haver circulação de ar). Coloração: Adicione a fucsina sobre o esfregaço previamente fixado; faz-se o aquecimento até a emissão de vapores, por 3 vezes, para facilitar a penetração da fucsina; derrama-se o corante na pia e lava-se o esfregaço com água; faz-se a descoloração com álcool-ácido e lava-se o esfregaço com água.
Material de linfonodo abdominal positivo paramicobactéria corado por Ziehl Ne lsene Fonte: www.fcm.unicamp.br
Apenas os BAAR presentes no esfregaço reterão a fucsina; adiciona-se o azul de metileno; lava-se o esfregaço com água e faz-se a leitura. Se houver BAAR na amostra eles ficarão vermelhos devido à retenção da fucsina e serão visualizados microscopicamente. O fundo azul no esfregaço faz o contraste para essa visualização.
2.5 PESQUISA DE BAAR POR AURAMINA:
Trata-se de um método de pesquisa de BAAR por fluorescência, mais sensível que os métodos tradicionais baseados na carbolfucsina (Ziehl-Neelsen). A auramina (o fluorocromo utilizado) liga-se ao ácido micólico da parede celular da micobactéria, resistindo à descoloracão do álcool-ácido e emitindo fluorescência Presença de BAAR, observados nacoloração de Auramina Fonte: www.thales.cica.es
amareloalaranjada sobre o fundo negro.
2.6 MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO:
A microscopia de Campo Escuro é uma técnica de análise direta, sem coloração ou tratamento prévio da amostra para visualização de espiroquetas, sendo o Treponema pallidum o mais importante. O Treponema pallidum , agente causador da Sífilis, doença infectocontagiosa, essencialmente transmitida pelo contágio sexual, é um patógeno exclusivamente humano, com caráter infectante apenas na fase aguda da doença. Após o contágio, a infecção apresenta um período de incubação médio de 3 semanas, após o qual se manifesta a lesão inicial, o cancro duro, com repercussão ganglionar inguinal bilateral e indolor, que evolui para auto-resolução, mesmo se não tratada, em cerca de 1 a 2 meses, sem deixar cicatrizes. Essa fase é denominada sífilis primária. Cerca de 2 a 3 meses após, aparecem as lesões generalizadas da sífilis secundária, que se caracterizam por erupção cutânea generalizada com acometimento palmoplantar. Caso não tratada, ela assume caráter sistêmico, evoluindo cronicamente, com períodos de atividade e de latência. Treponema pallidum em microscopia de campo escuro Cerca de 10% dos pacientes que apresentam a forma primária, caso não-tratados, evoluirão com neurossífilis. A neurossífilis assintomática é a forma mais comum de apresentação. Não há sinais ou sintomas clínicos. Acredita-se que os pacientes que apresentam alterações no líquor, mesmo sem sintomatologia, durante as fases iniciais da doença, tenham mais chances de evoluir para síndromes neurológicas tardias. A progressão das alterações neurológicas pode se dar com quadros de meningite sifilítica, sífilis meningovascular, meningoencefalite sifilítica, tabes dorsalis e sífilis medular. As características laboratoriais consistem no achado de alterações do liquor, aumento da proteína, redução da glicose ou positividade para a reação de VDRL.
e/ou laboratorial. Deve-se coletar o jato médio urinário após higiene da genitália externa. Em crianças, que não controlam a micção, fazer a higiene e colocar o saco coletor adesivo, que deve ser trocado a cada 30 minutos quando não tiver sido possível coletar a urina. A urina de paciente em uso de sonda vesical deve ser coletada na válvula lateral do equipo, após a desinfecção do mesmo. A urina do jato médio pode ser da primeira micção ou de qualquer amostra urinária, desde que o paciente retenha a urina por um período mínimo de 4 horas. A urina é um fluido normalmente estéril; por conseguinte, uma coleta inapropriada pode torná-la contaminada com a microbiota do períneo, da uretra e da vagina. As amostras permanecem estáveis até 2 horas após a coleta ou em geladeira (2ºC - 8ºC).
3.2 CULTURA DE MATERIAL DO TRATO GÊNITO URINÁRIO:
Importante no diagnóstico laboratorial das uretrites, vaginites, endocervicites, doenças sexualmente transmitidas e agentes bacterianos associados às infecções do trato genital. Secreção uretral, vaginal, urina 1o jato, esperma, secreção endometrial, fundo-de- saco uterino e secreção prostática são consideradas amostras clínicas apropriadas. As amostras clínicas coletadas com meio de transporte podem ser armazenadas por até 24 horas à temperatura ambiente. As urinas e swabs coletados sem meio de transporte devem ser processadas em até 2 horas. São considerados como crescimento patológico: Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus agalactiae, Haemophilus spp., Corynebacterium spp. e enterobactérias. A presença de Corynebacterium spp. e de enterobactérias é valorizada, principalmente em crianças, mas também em adultos, quando presentes em grandes quantidades e a critério médico.
3.3 CULTURA DE FEZES (COPROCULTURA):
A coprocultura auxilia o clínico no diagnóstico da etiologia de diarréias bacterianas, por meio do isolamento de patógenos entéricos. As gastroenterites podem ser causadas por bactérias, vírus ou parasitos. Quando é solicitada uma rotina de coprocultura, são procurados os agentes etiológicos mais freqüentes, tais como Shigella sp p., Salmonela spp. e Escherichia coli enteropatogênica. A E. coli enteropatogênica (EPEC) é pesquisada nos casos de diarréias em crianças de até 4 anos de idade. A E. coli enteroinvasora (EIEC) é pesquisada em todas as faixas etárias. Sua toxicidade é dada pela toxina que produz, a qual penetra na mucosa intestinal, provocando diarréia aguda. Em casos mais específicos, como as pesquisas de Campylobacter spp. e Yersinia spp ., o pedido médico deverá ser direcionado. Outros patógenos, como Aeromonas s pp. e Plesiomonas spp ., podem também ser isolados. Cabe lembrar que algumas espécies de Campylobacter spp. não crescem nas condições padronizadas para coprocultura. O crescimento abundante de germes como Pseudomonas aeruginosa , Candida spp ., Staphylococcus aureus , entre outros, pode indicar pacientes tratados com antibióticos de amplo espectro. Apesar de seu papel ainda não estar claramente definido, sua presença é comunicada ao médico, indicando a sua predominância. A cultura deve ser realizada de preferência a partir de fezes frescas. Caso não seja possível, pode-se enviar swab anal em gel de transporte ou fezes coletadas em meio de transporte (tampão glicerol). Para a pesquisa de Campylobacter spp ., são adequadas apenas fezes frescas ou colhidas em gel de transporte. Os swabs com meio de transporte e as fezes conservadas em tampão glicerinado podem ser armazenados à temperatura ambiente por até 24 horas.
3.4 CULTURA DE MATERIAL DO TRATO RESPIRATÓRIO SUPERIOR:
Inclui as culturas de secreções de orofaringe, nasofaringe, ocular e de ouvido. Auxilia os clínicos no diagnóstico das faringites bacterianas. A causa mais comum de faringite é representada pelo Streptococcus pyogenes. Em 7% dos casos, as secreções da nasofaringe são úteis no diagnóstico de sinusites infecciosas e na detecção de portadores nasais de germes como
transtraqueal, lavado brônquico e lavado broncoalveolar protegido e não-protegido. O escarro deve passar por uma observação microscópica, para se avaliar a qualidade da coleta e se é representativa do TRI ou se contém apenas saliva. O lavado broncoalveolar é obtido por meio de procedimentos invasivos, sendo recomendado na suspeita de pneumonias nosocomiais em paciente com ventilação mecânica. Os resultados da cultura de escarro são interpretados com base na avaliação da coloração de Gram preparada a partir da porção mais purulenta do escarro: se contém mais de 25 polimorfonucleares/campo ou até 10 células epiteliais/campo, observado através de objetiva de 10 X, o material é considerado satisfatório. A informação mais simples envolve a quantificação de um volume maior ou igual a 10 células epiteliais, com a objetiva de 40 X, o que seria inaceitável para a cultura. Nas culturas quantitativas, o volume do lavado broncoalveolar protegido coletado freqüentemente é de 0,01 mL a 0,001mL de secreção. A contagem de 103 UFC/mL de um microrganismo corresponde a infecção. Para o lavado broncoalveolar (LBA), a contagem de 10.000 UFC/mL ou mais de um microrganismo específico correlaciona-se com pneumonia. No lavado brônquico e no aspirado traqueal, a contagem de 106 colônias, ou seja, 1.000.000 UFC/mL, sugere um processo infeccioso. Os microrganismos mais freqüentemente isolados correspondem aos grupos dos bastonetes gram-negativos não-fermentadores ou entéricos, os estafilococos e enterococos. São eles: Staphylococcusaureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus spp ., Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae e Rhodococcus equi.
3.6 CULTURA DE MICOBACTÉRIAS:
A realização da cultura de micobactérias utiliza como princípio biológico a detecção radiométrica do CO 2 produzido pela atividade metabólica das micobactérias a partir de meios de cultura específicos marcados com C14. É destinada ao diagnóstico da tuberculose e das micobacterioses [complexo M. tuberculosis e micobactérias não-
tuberculose (MNT)]. Pode ser realizada em escarro, lavado brônquico, lavado broncoalveolar, líquido ascítico, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido cefalorraquidiano, aspirado de medula óssea, sangue, fezes, biópsias e urina. O uso de antituberculostáticos, e a presença de micobactérias não-adaptadas ao crescimento em meio liquido ou à temperatura de 35ºC podem induzir a um resultado falso-negativo.
3.7 CULTURA DE ANAERÓBIOS:
Os materiais clínicos adequados para a realização da cultura de bactérias anaeróbias devem provir das cavidades fechadas do nosso organismo (coleções líquidas, abscessos, sangue e líquidos biológicos em geral) ou seja, sítios estéreis, sem a presença da microbiota normal. As bactérias anaeróbias causam uma variedade de infecções humanas, incluindo peritonite, empiema, endocardite e artrite. As infecções anaeróbias são, geralmente, de fonte endógena, representada pela própria microbiota normal. Entretanto, apesar da grande variedade de anaeróbios da flora normal, as infecções são limitadas a uma pequena quantidade de microrganismos, na qual se destacam o isolamento do gênero Bacteroides spp. Peptostreptococcus spp., Prevotella spp. e Clostridium perfringens. Os materiais devem ser colhidos e inoculados em frascos anaeróbios de hemocultura, até o volume máximo permitido, que é de 8 mL. Quando o material for sangue e líquidos biológicos, pode ser armazenado por um período de até 24 horas, à temperatura ambiente, em frascos anaeróbios. Não poderão ser utilizados para pesquisar microrganismos anaeróbios materiais provenientes de sítios que normalmente participem da flora normal ou transportados inadequadamente.
3.8 CULTURA DE SECREÇÕES, ABCESSOS, TECIDO SUBCUTÂNEO, FRAGMENTO DE TECIDOS E BIÓPSIAS:
bacteremia pode ocorrer de forma transitória, intermitente ou contínua. Além disso, seus produtos metabólicos interagem com os mecanismos de resposta inflamatória, podendo levar à septicemia e ao choque, que é uma das mais sérias complicações das doenças infecciosas. A(s) bactéria(as) responsável(is) pode(m) ser identificada(s) pela realização da cultura do sangue (hemocultura) e é (são) útil (eis) no diagnóstico etiológico e na escolha da terapia. Para o diagnóstico, é importante a coleta de mais de uma amostra (mínimo de 2, ideal de 3), antes da administração de antimicrobianos. O número de amostras e o intervalo entre as coletas dependem do quadro clínico investigado. Nas bacteremias agudas e/ou contínuas, recomenda-se a coleta de 3 amostras com intervalo de 1 a 2 horas. Já nas intermitentes, recomenda-se a coleta em intervalos menores e antes ou imediatamente após o início do pico febril. Para a coleta, deve-se fazer anti-sepsia da pele, com álcool a 70%, 2 vezes, e esperar a ação do anti-séptico durante 2 minutos. Essa operação também pode ser realizada utilizando-se uma primeira anti-sepsia com álcool a 70%; posteriormente, utilizar álcool iodado. Puncionar a veia e coletar o número de amostras no intervalo de tempo indicado. Deve-se evitar a coleta de sangue na região inguinal. O material biológico utilizado pode ser sangue arterial ou venoso, aspirado de medula óssea ou de qualquer outro líquido biológico. Podem ser coletados também líquidos de cavidades fechadas para cultura de anaeróbios. Quando o material for sangue, o volume coletado é um dos mais importantes parâmetros na detecção de bactérias na corrente circulatória. Coletar os seguintes volumes nas diferentes faixas etárias: crianças de até 1 ano: 0,5 mL a 1,5 ml em cada frasco de cultura; crianças de 1 ano a 6 anos: 1,0 mL para cada ano de idade; adultos: 20 mL de sangue para cada amostra de hemocultura. Quando for utilizada para cultura de líquidos biológicos, qualquer volume do espécime pode ser utilizado. O sangue coletado é acondicionado em frascos especiais com meio líquido diferentes de acordo com o tipo de bactéria a ser investigada (aeróbia ou anaeróbia).
A rapidez na identificação etiológica do agente bacteriano é essencial para a decisão precoce e adequada do tratamento específico. Os métodos modernos automatizados permitem a liberação rápida dos resultados. Nesses métodos, a presença de bactérias é detectada pelo CO 2 produzido durante o crescimento bacteriano, que irá modificar o sensor existente no fundo do frasco de cultura, proporcionando a emissão de fluorescência, por sua vez detectada pelo aparelho utilizado para leitura. A presença de crescimento bacteriano no sangue do paciente indica bacteremia e/ou septicemia. Alguns patógenos devem ser questionados quanto ao seu poder patogênico, como por exemplo o achado de estafilococos coagulase-negativos em uma única amostra, Propionebacterium acne e grupo Corynebacterium. Nas infecções hospitalares, os patógenos mais encontrados são Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp. e estafilococos coagulase-negativos. Nas endocardites, os agentes mais freqüentemente isolados correspondem aos Estreptococcus spp. alfa-hemolíticos ou mesmo beta-hemoliticos, assim como aos Staphylococcus aureus e aos estafilococos coagulase-negativos. O anticoagulante utilizado no meio de cultura (SPS) inativa o sistema complemento, porém inibe o crescimento das Neisseria spp. e Gardnerella vaginalis. As bactérias com exigências especiais, tais como Brucella spp., Leptospira spp., Bartonella spp., Legionella spp., Mycobacteria spp ., não crescem nos meios tradicionalmente usados para hemoculturas.
3.10 CULTURA DE LÍQUOR:
O material é colhido por meio de punção lombar, de preferência sem o uso de antimicrobiano prévio. O volume mínimo não deve ser inferior a 1,0 mL. As amostras devem ser enviadas o mais rapidamente possível para o laboratório, sem refrigerar - tempo admissível para o transporte: 2 horas. A presença de crescimento bacteriano de qualquer microrganismo após a incubação é considerada patogênica, uma vez que o liquor é estéril.
O isolamento e a identificação de fungo em cultura são prova definitiva no diagnóstico de infecções fúngicas, permitindo a escolha do tratamento adequado. Os diferentes materiais clínicos são semeados nos meios de cultura apropriados para isolamento e identificação de fungos. As amostras deverão ser coletadas de maneira asséptica em frasco estéril, conforme a natureza do material clínico. Os materiais biológicos requeridos são: escamas de pele, unhas, pêlos (micoses superficiais e cutâneas); aspirado de lesão, secreções, biópsias de pele (micoses subcutâneas); escarro, lavado brônquico, aspirado brônquico, escovado brônquico (micoses sistêmicas); secreções: pulmonar, vaginal, traqueal, orotraqueal, de lesões cutâneas, abdominal, oral, de conjuntivas ou de qualquer outra localização (micoses sistêmicas); sangue, biópsia de qualquer órgão ou tecido, urina, liquor, líquidos sinovial, ascítico, amniótico ou outros líquidos orgânicos (micoses sistêmicas). Os resultados serão interpretados de acordo com o tipo de material clínico semeado, o local da lesão e a indicação clínica. Alguns fungos são parte da flora normal, mas podem, ocasionalmente, causar doenças. Do mesmo modo, fungos oportunistas podem tanto ser apenas contaminantes como os reais causadores da patologia em investigação. Muitas vezes, o médico solicitante deve ser consultado sobre a condição clínica do paciente, para que se possa concluir qual o real valor do isolamento de determinados fungos. A presença de microrganismos da flora normal ou de infecção bacteriana concomitante pode inibir o crescimento de fungos patogênicos.
4. ANTIBIOGRAMA OU TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS (TSA):
O antibiograma talvez seja o exame microbiológico de maior importância, uma vez que indica para o clínico quais os antibióticos/quimioterápicos eficazes contra o agente causador da infecção.
Antes de mais nada, o que mais importa não é a identificação bacteriana e sim quais os medicamentos que irão combater o agente causador da infecção, independente de qual seja esse agente. A identificação bacteriana é uma espécie de “pré-requisito” uma vez que é necessário isolar o agente causador da infecção antes de realizar o teste e desta forma, realiza-se a identificação do mesmo. A identificação do agente causador é de importância como um dado complementar, epidemiológico, etc. O Teste de Sensibilidade com difusão em discos é utilizado pelos laboratórios há mais de 70 anos. Em 1966, Bauer, Kirby, Sherris e Turck publicaram o artigo original após padronizarem o método do disco difusão. Após a publicação, o NCCLS ( National Commitee for Clinical Laboratory Standards ), adota o método como referência passando o mesmo a ser utilizado até os tempos atuais. Existem vários comitês de padronização, cada um com suas peculiaridades que refletem as características de cepas bacterianas estudadas em seus respectivos países. Alemanha, Inglaterra, França e Estados Unidos possuem comitês que podem ser considerados como referência. O Brasil ainda não possui nenhum comitê, porém utiliza-se as padronizações do NCCLS. Atualmente a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) comprou os direitos autorais, na Língua Portuguesa, do manual do NCCLS e suas atualizações, por cinco anos. Esse manual de padronização do instituto norte- americano é dividido em cinco módulos e mensura a sensibilidade de agentes (bactérias e microrganismos em geral) a diversos antimicrobianos. O acesso gratuito ao manual diminui o custo laboratorial e possibilita resultados muito mais precisos, pois padroniza as técnicas de pesquisa e análise. O NCCLS é uma organização americana privada, conveniada a especialistas da industria, meio acadêmico e governo, que desenvolve normas para laboratórios clínicos. O órgão tem como função desenvolver procedimentos técnicos. Não avalia, não endossa, não recomenda nenhum sistema comercial para Teste de Sensibilidade. Atualmente o NCCLS foi renomeado para CLSI ( Clinical and Laboratory Standards Institute ).
