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1 INTRODUÇÃO
Praticamente toda a enorme variedade de reações bioquímicas que constituem a vida é mediada por uma série de catalisadores biológicos importantíssimos, conhecidos como enzimas. As enzimas se diferem dos catalisadores químicos comuns em muitos aspectos importantes. As principais características das enzimas são: 1) elevar a velocidade de reações, 2) maior especificidade de reação (pelos substratos); 3) condições de reações mais brandas; 4) capacidade de regulação; 5) saturação pelo substrato [VOET, 2006]. Determinações da cinética de reações catalisadas por enzimas encontram-se entre as técnicas mais poderosas para elucidar o mecanismo catalítico das mesmas. Uma das maneiras de se determinar dados de uma cinética enzimática é através da resolução da equação de Michaelis-Menten.
- A equação de Michaelis-Menten
O estudo da cinética enzimática começou em 1902, quando Adrian Brown relatou uma investigação sobre a velocidade da hidrólise da sacarose pela invertase (agora conhecida como -frutofuranosidase) de levedura Saccharomyces cerevisae. A invertase é uma enzima valiosa devido à sua aplicação em provas analíticas, em confeitarias e na indústria alimentícia, para a produção de “xarope de glicose invertido”. A invertase hidrolisa a sacarose para produzir glicose e frutose: Sacarose + H2O^ F 0E 0 Glicose + Frutose Quando a concentração de sacarose (substrato) é muito maior do que a concentração da enzima, a velocidade da reação torna-se independente da concentração de sacarose, ou seja, a ordem da reação é zero. Brown então propôs que a reação total é formada por duas reações elementares, uma na qual o substrato forma um complexo com a enzima, e subseqüentemente, decompõe-se no produto e na enzima (Figura 1):
FIGURA 1: Esquema geral da cinética enzimática.
Onde E, S, ES e P são, respectivamente, a enzima, o substrato, o complexo enzima- substrato e os produtos. Nesse modelo, k 1 é a constante de velocidade de formação de ES.
O complexo ES pode então seguir dois caminhos: dissociar-se novamente em E e S, com uma constante de velocidade k2, ou formar P com uma constante de velocidade k^ 3, conforme ilustra a Figura 2.
FIGURA 2: Constantes de velocidade da cinética enzimática.
A expressão geral para a velocidade dessa reação é (1): (1) A velocidade total da produção de ES é a diferença entre as velocidades das reações elementares que levam ao seu aparecimento e ao seu desaparecimento (2): (2) Em um estado estacionário, as concentrações de ES permanecem constantes (logo, ), enquanto o dos materiais de partida e dos produtos muda. Isso ocorre quando as velocidades de formação e de quebra do complexo ES são iguais (3): (3) Rearranjando, temos a equação (4): (4) Onde KM é a constante de Michaelis, definida como (5): (5) As quantidades de [ES] e [E] geralmente não são mensuráveis diretamente, ao contrário da concentração total da enzima [E] (^) T (6): (6) F 0E 0 Aplicando (6) na equação (4) e rearranjando, temos (7): (7) A velocidade inicial (1) pode então ser expressa nos termos da equação (7), conforme equação (8): (8) A velocidade máxima (9) da reação ocorre em altas concentrações de substrato, quando a enzima está saturada, o que corresponde quando ela estiver inteiramente na forma de [ES]: (9)
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- 13 tubos de ensaio
- 1 proveta de 25 ml
- 1 pisseta
- Suporta para tubo
- 2 cubetas para espectrofotômetro
- 1 erlenmayer
- (^) 1 caixa com gelo
- Caneta para marcar os tubos
- Fita crepe
- Pipetas de 2 ml e 5 ml
- Micropipetas P200 e P
- Ponteiras de micropipetas
- (^) Banho fervente
- Banho à 37ºC
- Tampão acetato 0,02mol/l
- Sacarose 1%
- Solução padrão redutora
- DNS
- Solução de enzima Invertase
- Água Destilada
- Espectrofotômetro
3.2 Métodos
3.2.1 Parte 1 – Construção da curva padrão Adicionou-se à seis tubos soluções de acordo com a tabela abaixo: Tabela 1 - Reagentes da parte 1 Tubo Solução Padrão Redutora 12nM (ml)
Tampão pH 4.77 (ml)
Reagente DNS (ml) Branco -- 2,0 2, 1 0,2 1,8 2, 2 0,4 1,6 2, 3 0,6 1,4 2, 4 0,8 1,2 2, 5 1,0 1,0 2,
Após os tubos estarem prontos ferveu-se por 10 minutos. Após esse tempo esfriou- se em água corrente e adicionou-se 16 ml de água destilada em cada tubo. Leu-se a absorbância à 540nm contra o branco.
3.2.2 Parte 2 – Efeito da concentração de substrato na atividade enzimática
- Numerou-se sete tubos em recipiente com gelo e adicionou-se solução à eles de acordo com a tabela abaixo: Tabela 2 - Reagentes da parte 2 Tubo Sacarose 30 mM (30mmoles/L) em tampão (ml)
Tampão pH 4.77 (ml)
Solução enzima (40μg/ml) (ml) Branco -- 1,5 0, 1 0,1 1,4 0, 2 0,2 1,3 0, 3 0,3 1,2 0, 4 0,5 1,0 0, 5 0,7 0,8 0, 6 1,0 0,5 0,
Tubo 2: 12,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,4 mL Solução Padrão = 4,8 μmol = 4,8x10 -3^ mmol [Solução Padrão] 0,24μmol/mL
Tubo 3: 12,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,6 mL Solução Padrão = 7,2 μmol = 7,2x10 -3^ mmol [Solução Padrão] 0,36μmol/mL
Tubo 4: 12,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,8 mL Solução Padrão = 9,6 μmol = 9,6x10 -3^ mmol [Solução Padrão] 0,48μmol/mL
Tubo 5: 12,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,4 mL Solução Padrão = 12 μmol = 12x10 -3^ mmol [Solução Padrão] 0,60μmol/mL
4.1.2 – Cálculo da concentração da sacarose hidrolisada Levando-se em consideração que a cada sacarose produz glicose e frutose, ou seja, dois açucares redutores, obteve-se os seguintes resultados da Tabela 1:
TABELA : [SACAROSE HIDROLISADA] Tubo [sacarose hidrolisada] (μmol/mL) 1 0, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0,
4.1.3 – Apresentação dos resultados obtidos: Os resultados obtidos são através dos cálculos e a absorbância obtida experimentalmente podem ser observados na Tabela 2:
TABELA : RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS Tubos [solução redutora] (μmol/ mL)
[sacarose hidrolisada] (μmol/ mL)
Abs (540nm)
Branco - 0 0 1 0,12 0,06 0, 2 0,24 0,12 0, 3 0,36 0,18 0, 4 0,48 0,24 0, 5 0,60 0,30 0,
4.2.1 – Cálculo da concentração inicial da sacarose Tubo branco = 0,0 μmol Tubo 1: 30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,1 mL [Sacarose Inicial] 1,5mM
Tubo 2: 30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,2 mL [Sacarose Inicial] 3,0mM
Tubo 3: 30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,3 mL [Sacarose Inicial] 4,5mM
Tubo 4: 30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,5 mL [Sacarose Inicial] 7,5mM
Tubo 5: 30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 0,7 mL [Sacarose Inicial] 10,5mM
Tubo 6:
30,0 mmol -------------------- 1000 mL X -------------------- 1,0 mL [Sacarose Inicial] 15,0mM
A Tabela 4 serviu de base para a construção do gráfico da Figura 6: TABELA 4: Resumo dos dados obtidos Abs (540 nm) [sacarose inicial] (mM)
Velocidade inicial de reação (μmol/ mL/ min) 0,12 1,5 0, 0,20 3,0 0, 0,31 4,5 0, 0,45 7,5 0, 0,56 10,5 0, 0,67 15,0 0.
FIGURA 6: Gráfico [Sacarose Inicial] x Velocidade Inicial
Observando o gráfico da Figura 6 podemos estimar o valor da velocidade máxima () da reação que se encontra em aproximadamente 0,08 μmols de sacarose hidrolisada/ mL/ min. Com a equação de Michaelis-Menten (A) torna-se possível descrever a cinética de ação de uma enzima, na curva do gráfico. (A) , onde e
(C)
Para x=0, 1/ V (^) máx. = y (D): (D)F 0 E 8F 0 E 8 Logo, temos o valor de V (^) máx. (E): (E)F 0 E 8 O valor de V (^) máx obtido na equação (E) é diferente do observado no gráfico da Figura 6, pois no experimento foram lidados com valores muito pequenos, suscetíveis a erros de medição, e também porque não se alcançaram pontos suficiente para plotar o gráfico de forma que facilitasse a visualização da velocidade máxima real. Para o cálculo de K (^) m utiliza-se a equação de reta obtida do gráfico da Figura 7 (C). Para y=0, -1/ Km. = x (F): (F)F 0 E 8 Logo, temos o valor de K (^) m (G): (G)F 0 E 8
4.3 – Invertase na Indústria É muito utilizado pela indústria de alimentos, uma vez que a frutose tem mais capacidade de adoçar do que a sacarose(cerca de 40%) e não cristaliza tão facilmente melhorando a textura de doces e sorvetes. Também é utilizado na fabricação de refrigerantes e alimentos congelados.
4.4 – Solução de Enzima Hexoquinase
A solução da enzima hexoquinase, que atua na via glicolítica, de características Michaelianas, possui um valor de K (^) m igual a 0,15 mM para a glicose e 1,5 mM para a frutose. A velocidade máxima da reação (V (^) máx. ) neste sistema foi a mesma para os dois substratos, sendo iguais a 50 mmol substrato/ min. Na Tabela 6 encontram-se os valores de concentração inicial do substrato [S] em mM (com intervalos de 0,5 K (^) m ) e o inverso da concentração inicial do substrato 1/[S] em mM-^. TABELA 6: Concentração inicial de substrato S 1/S
1,0 1, 1,5 0, 2,0 0, 3,0 0, 4,5 0, 5,0 0, 7,5 0, 10,5 0, 15,0 0, 30,0 0, 50,0 0,
Utilizando a equação de Michaelis-Menten e seguindo os mesmos procedimentos feitos nas etapas 4.1 e 4.2 desta discussão, foi possível obter as velocidades iniciais de reação, como mostra a Tabela 7.
TABELA 7 – Velocidades da Glicose e da Frutose
Construiu-se o gráfico de Lineweaver-Burk, conforme a Figura 9:
Figura 9: Gráfico de Lineweaver-Burk. Com o gráfico de Lineweaver-Burk, foi possível calcular os valores de V (^) máx e K (^) m para a glicose e a frutose.
- Glicose: para a glicose, utiliza-se a equação de reta obtida do gráfico da Figura 9 – linha preta (H): (H) Para x=0, 1/ V máx. = y (I): (I)F 0 E 8F 0 E 8 Assim, temos o valor de V (^) máx. para a glicose (J):
(J)F 0 E 8
Para y=0, -1/ Km. = x (K): (K)F 0 E 8 Logo, temos o valor de K (^) m para a glicose (L): (L)F 0 E 8
- Frutose: para a frutose, utiliza-se a equação de reta obtida do gráfico da Figura 9 - linha cinza (M): (M) Cálculo de V (^) máx:^ para x=0, 1/ Vmáx. = y (N): (N)F 0 E 8F 0 E 8 Logo, temos o valor de V (^) máx. para a frutose (O): (O)F 0 E 8 Cálculo de Km : para y=0, -1/ K (^) m. = x (P): (P)F 0 E 8 Logo, temos o valor de K (^) m para a frutose (Q): (Q)F 0 E 8
Ao realizar os cálculos de V (^) máx., foi observado que as duas retas cortam o eixo das ordenadas em um mesmo ponto (0,02), confirmando o caso do V (^) máx. da glicose = Vmáx. da frutose, que é de 50 mmol/ mL/ min. No gráfico da Figura 8, o valor de K (^) m é equivalente ao valor da concentração do substrato quando se atinge a metade da velocidade máxima da
