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Tipologia: Trabalhos
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Universidade Federal de Itajubá - Campus Itabira Curso de Engenharia Ambiental Disciplina: Microbiologia Ambiental - Prática Relatório de aula prática Pratica 3: Determinação da curva de crescimento de S accharomyces cerevisiae em diferentes meios de cultura. RAYANNE RAMOS SILVA 2022003030 ITABIRA, 2023
Objetivos Determinar a taxa de especifica de crescimento (μ) e o tempo de geração (g) com a elaboração de uma curva de crescimento de Saccharomyces cerevisiae. Procedimentos Metodológicos Para observar o crescimento populacional microbiano utilizou-se a levedura Saccharomyces cerevisiae presente no fermento biológico em pó. Foram utilizados dois meios de cultura diferentes, o caldo triptona de soja (TBS), caldo lactose e sacarose, o que os difere são os nutrientes presentes em cada meio. Os meios de cultura TBS e caldo de lactose foram dispostos em 12 tubos de Falcon autoclavados com o volume de 10ml em cada tubo, totalizando 6 amostras de TBS e 6 amostras de lactose. Posteriormente, foi pesado 0,3g da levedura e diluída em 100 mL de água destilada e adicionado aos tubos. Foi acrescentado sacarose em dois tubos com a levedura+TBS e dois tubos com levedura+lactose, a adição de sacarose possibilita a análise do desenvolvimento da levedura quando adicionado uma fonte de carbono. Em seguida, para obter número de células em cada tubo foi usado o espectrofotômetro, que mede a quantidade de luz absorvida, com isso é possível levantar indiretamente a quantidade de célula em cada tubo. Um tubo sem leveduras foi utilizado como zero/branco servindo de parâmetro para as demais análises. Após a análise dos tubos, foi realizado a contagem dos microrganismos através da câmera de Neubauer que apresenta uma área quadriculada que facilita a contagem que foi realizada com o auxílio de um contador. Em seguida os tubos foram separados da seguinte maneira a serem armazenados nas estufas de 25°C e 40°C. Na estufa de 25°C: 2 tubos com TBS e levedura, 2 tubos com lactose e levedura, 1 tubo com TBS, levedura e sacarose e 1 tubo com lactose, levedura e sacarose. Na estufa de 40°:2 tubos com TBS e levedura, 2 tubos com lactose e levedura, 1 tubo com TBS, levedura e sacarose e 1 tubo com lactose, levedura e sacarose. Por último, para a análise ainda a ser discutida, o monitoramento dos tubos foi feito por três dias através da medição da absorbância no espectrofotômetro com o intervalo de duas horas. A partir das medições foi construído tabelas que geraram as curvas de crescimento, esses gráficos foram submetidos a regressão linear e a partir da equação do gráfico se obteve o tempo de geração (g), constante de crescimento (μ), dados que auxiliam na avaliação de fatores que influenciam o crescimento microbiano.
Resultados e Discussão Densidade óptica Células por mililitro 0 0, 0,044 3,80E+ 0,075 5,68E+ 0,269 1,73E+ 0,678 7,45E+ 1,252 1,65E+ 1,962 2,98E+ Tabela 1: Número de células por mililitro a partir da densidade óptica A partir da tabela 1, foi plotado o gráfico 1 com linha de tendência Gráfico 1: população por densidade óptica Com os valores de densidade óptica obtida e a relação feita pela contagem de microrganismos na câmara de Neubauer resultou na criação do gráfico 1. O valor da linha de tendência do gráfico 1 foi de 14.219.864, que multiplicado com a média D.O determinou o valor da população de microrganismos em cada meio (Equação 1). 0 0.5 1 1.5 2 2. 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000 f(x) = 14219864.3712455 x R² = 0. f(x) = 14219864.3712455 x R² = 0.
Series Linear (Series2) Linear (Series2)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 LN DA POPULAÇÃO TBS 25°C TEMPO(H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 3: Ln da população X tempo em horas, no meio TBS. 0 5 10 15 20 25 30
f(x) = 0.106935034345701 x + 13. R² = 0. FASE EXPONENCIAL MEIO TSB 25°C TEMPO (H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 3: fase exponencial do meio TBS a 25°C. O gráfico da fase exponencial é utilizado para a análise devido a sua representatividade do crescimento do microrganismo. Partindo da equação da população final dada como: ( N )= NO ∗ 2 n (^) (Equação 2) onde: 𝑁 = 𝑃𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑁0 = 𝑃𝑜𝑝𝑢𝑙𝑎çã𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑛 = 𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑔𝑒𝑟𝑎çõ𝑒𝑠 Relacionando a equação 2 com a taxa específica de crescimento(μ) e o tempo de geração (g) que são definido da seguinte maneira: μ = 𝑙𝑛 2/ 𝑔 ou μ = 0, 693/𝑔 (Equação 3) 𝑔 = 𝑡/𝑛 (Equação 4) onde: 𝑡 = 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑑𝑢𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝑐𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑒𝑥𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑙. Multiplicando a equação 2 por Ln temos: 𝑙𝑛 𝑁 = 𝑛 0, 693 + 𝑙𝑛 𝑁 0 (Equação 5) como 𝑛 = 𝑡/𝑔, substituindo na equação 5, temos como equação final: 𝑙𝑛 𝑁 = (0, 693/𝑔) * 𝑡 + 𝑙𝑛 𝑁 0 (Equação 6) Relacionado a equação gerada na regressão linear do gráfico 3 (y = 0,1069x + 13,065) com a equação 6, concluímos que o valor independente corresponde a NO e o valor que acompanha x corresponde a μ, ou seja, NO = 13,065 e μ=0,1069. Com o valor de μ é possível determinar g , temos: 0, 1069 = 0, 693/ 𝑔 g = 6, 48 H o tempo de geração é de aproximadamente 6,48 horas, ou seja, os microrganismos dobraram sua população no meio TBS a 25°C em 6,48 horas. A partir do valor de g calcula- se o valor de n utilizando a equação 5_._ 𝑙𝑛 𝑁 = 𝑛 0, 693 + 𝑙𝑛 𝑁 0 𝑙𝑛 𝑁 = 16, 75 𝑙𝑛 𝑁0 = 13, 06 Substituindo: 16, 75 = 𝑛 0, 693 + 13, 06 𝑛 = 5, 32 Com o valor de n determinado, posteriormente foi calculado o valor do tempo de duração do crescimento exponencial através da equação 4:
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 13
14
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TEMPO(H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 5: Ln da população X tempo em horas, no meio TBS a 40°C. Gráfico 6: Ln da população X tempo em horas, no meio caldo de lactose a 40°C 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 2 4 6 8 10 12 LN DA POPULAÇÃO CALDO LACTOSE 40°C TEMPO (H) LN DA POPULAÇÃO 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12
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16
f(x) = 0.0709230277661768 x + 12. R² = 0. FASE EXPONENCIAL TBS 40°C TEMPO (H) LN DA POPULAÇÃO
Gráfico 7: Fase exponencial do TBS a 40°C; Relacionado a equação gerada na regressão linear do gráfico 7 (y = 0,0709x + 12,6) com a equação 6, concluímos que o valor independente corresponde a NO e o valor que acompanha x corresponde a μ, ou seja, NO = 12,6 e μ=0,0709. Com o valor de μ é possível determinar g , temos: 0, 0709 = 0, 693/ 𝑔 g = 9,77 H o tempo de geração é de aproximadamente 9,77 horas, ou seja, os microrganismos dobraram sua população no meio TBS a 25°C em 6,48 horas. A partir do valor de g calcula- se o valor de n utilizando a equação 5_._ 𝑙𝑛 𝑁 = 𝑛 0, 693 + 𝑙𝑛 𝑁 0 𝑙𝑛 𝑁 = 16, 26 𝑙𝑛 𝑁0 = 12, Substituindo: 16, 26= 𝑛 0, 693 + 12, 𝑛 = 5, 29 Com o valor de n determinado, posteriormente foi calculado o valor do tempo de duração do crescimento exponencial através da equação 4: 𝑔 = 𝑡/𝑛 𝑔 = 9, 𝑛 = 5, 29 Substituindo: 9,77 = 𝑡/5, 29 𝑡 = 51,68 horas De tal maneira temos que tempo de duração do crescimento exponencial do TBS á 40°C foi de 51,68 horas. TSB + SACAROSE 25°C LACTOSE + SACAROSE
Gráfico 9: Ln da população X tempo em horas, no meio lactose+ sacarose a 25°C. 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 f(x) = 0.0682423780311735 x + 13. R² = 0.
TEMPO (H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 10: Fase exponencial do meio TBS+ sacarose a 25° C. 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 f(x) = 0.0758422886446702 x + 13. R² = 0.
TEMPO(H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 11: Fase exponencial lactose+ sacarose a 25°C. Relacionado a equação gerada na regressão linear do gráfico 10 (y = 0,0682x + 13,56) com a equação 6, concluímos que o valor independente corresponde a NO e o valor que acompanha x corresponde a μ, ou seja, NO = 13,56 e μ=0,0682. Com o valor de μ é possível determinar g , temos:
g =10,16 H o tempo de geração é de aproximadamente 10,16 horas, ou seja, os microrganismos dobraram sua população no meio TBS+ sacarose a 25°C em 10, horas. A partir do valor de g calcula- se o valor de n utilizando a equação 5_._ 𝑙𝑛 𝑁 = 𝑛 0, 693 + 𝑙𝑛 𝑁 0 𝑙𝑛 𝑁 = 17, 𝑙𝑛 𝑁0 = 13, Substituindo: 17,15 = 𝑛 0, 693 + 13, 𝑛 = 5, 18 Com o valor de n determinado, posteriormente foi calculado o valor do tempo de duração do crescimento exponencial através da equação 4: 𝑔 = 𝑡/𝑛 𝑔 = 10, 𝑛 = 5, 18 Substituindo: 10,16 = 𝑡/5, 18 𝑡 = 52,62 horas De tal maneira temos que tempo de duração do crescimento exponencial do TBS+ sacarose á 25°C foi 52,62 de horas. Relacionado a equação gerada na regressão linear do gráfico 11 (y = 0,0758x + 13,56) com a equação 6, concluímos que o valor independente corresponde a NO e o valor que acompanha x corresponde a μ, ou seja, NO = 13,56 e μ=0,0758. Com o valor de μ é possível determinar g , temos: 0, 0758= 0, 693/ 𝑔 g =11,98 H o tempo de geração é de aproximadamente 11,98 horas, ou seja, os microrganismos dobraram sua população no meio lactose+ sacarose a 25°C em 11, horas. A partir do valor de g calcula- se o valor de n utilizando a equação 5_._
Tabela 5: Ln da população nos meio TBS+ sacarose e lactose+ sacarose a 40°C. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 13
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18 TBS+ SACAROSE 40°C TEMPO(H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 12: Ln da população X tempo em horas, no meio TBS+ sacarose a 40°C. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
14
LACTOSE+SACAROSE 40°C TEMPO(H) LN DA POPULAÇÃO Gráfico 13: Ln da população X tempo em horas, no meio lactose+ sacarose a 40°C. Observamos pelo gráfico 12 que no meio lactose+ sacarose não houve crescimento dos microrganismos
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 13
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18 f(x) = 0.22630055956742 x + 13. R² = 1 FASE EXPONENCIAL TBS+ SACAROSE 40°C TEMPO(H) LN DA POPULAÇAÕ Gráfico 14: Fase exponencial TBS+ sacarose a 40°C. Relacionado a equação gerada na regressão linear do gráfico 14(y = 0,2263x + 13,13) com a equação 6, concluímos que o valor independente corresponde a NO e o valor que acompanha x corresponde a μ, ou seja, NO = 0,22 e μ=0,0758. Com o valor de μ é possível determinar g , temos: 0, 02263 = 0, 693/ 𝑔 g =3,06H o tempo de geração é de aproximadamente 10,16 horas, ou seja, os microrganismos dobraram sua população no meio TBS a 25°C em 10,16 horas. A partir do valor de g calcula- se o valor de n utilizando a equação 5_._ 𝑙𝑛 𝑁 = 𝑛 0, 693 + 𝑙𝑛 𝑁 0 𝑙𝑛 𝑁 = 17, 𝑙𝑛 𝑁0 = 13, Substituindo: 17,35 = 𝑛 0, 693 + 13, 𝑛 = 6, Com o valor de n determinado, posteriormente foi calculado o valor do tempo de duração do crescimento exponencial através da equação 4: 𝑔 = 𝑡/𝑛 𝑔 = 3, 𝑛 = 6,
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