Relatório microbiologia, Manuais, Projetos, Pesquisas de Microbiologia

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FACULDADE DE TECNOLOGIA E CIENCIAS - ITABUNA

Curso de Medicina Veterinária II

CLÁUDIA ALVES MASCARENHAS

RELATÓRIO AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

ITABUNA – BAHIA

3 Sumário 1.Introdução 2 2.Objetivo 4 3.Materiais 4 4.Metódos 6 4.1. Aula Prática I 5 4.1.1 Protocolo:Coloração de Gram 6 4.1.2. Coleta de microrganismos 11 4.2. Aula Prática II 11 4.2.1. Material coletado na aula anterior 11 4.3 Aula Prática III 17 4.3.1 Verter o Meio de Cultura 17 4.3.2 Técnica de Esgotamento por Estriamento Simples e Estriamento Composto 17 Referências Bibliográficas 27

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1. INTRODUÇÃO

A aula prática foi dividida em três etapas, a primeira no dia 11/11/19 onde foi apresentada as normas de segurança do laboratório, demonstração dos materiais e equipamentos e a técnica de coloração de Gram e coleta de microrganismo, a segunda no dia 19/11/19 com a observação dos microrganismos coletados na aula anterior e fases de crescimento bacteriano; terceira etapa no dia 22/11/19. A técnica de coloração de Gram foi desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884, é um método utilizado para identificar os dois tipos de bactérias, as Gram positivas e as Gram negativas. Esse método consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, que é fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool e safranina. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas que retêm o corante cristal violeta adquirindo a cor púrpura e Gram-negativas que não retêm o cristal violeta e permanecem incolores tornando-se cor-de-rosa com a aplicação da safranina. A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. Os meios de cultura são produtos contendo nutrientes corretos em quantidades e proporções, condições adequadas de incubação, PH ajustado e estéril estimulando o crescimento (aumento em quantidade) e desenvolvimento dos microrganismos procurando imitar o seu ambiente natural, permitindo seu estudo, identificação e análise. Os principais componentes de um meio de cultura são fontes de carbono, energia (açúcares), nitrogênio, fósforo e sais minerais. Dependendo do microrganismo a ser analisado e o tipo de análise a ser realizada. a) Quanto ao estado físico meios de cultura podem ser: Sólido – Servem para isolar colônias, cultivar ou verificar características, 1,5% de ágar (polissacarídeo extraído de algas marinhas); Líquidos – o crescimento microbiano é evidenciado pela turvação do meio líquido, não permite saber quantos tipos de microrganismos cresceram; Semi-sólidos – servem para verificar a motilidade microbiana, 0.5% de ágar. b) Descrição de Alguns meios de cultura:

3 Seletivo – os meios seletivos contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros, ou seja, tem o objetivo de favorecer o crescimento de bactérias de interesse e impedir o crescimento de outras bactérias.  Agar Verde Brilhante - é um meio de cultura utilizado para o isolamento seletivo de Salmonella. Composição: Extrato de levedura 3,0g; Peptona Proteose 10,0g; Lactose 10,0; Sacarose 10,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; Vermelho de fenol 0,08 g; Ágar 20,0 g; Brilliant Green 12,5 mg. Diferencial – é aquele que contém substâncias que permitem estabelecer diferenças entra bactérias parecidas, sendo utilizado para identificação da colônia de bactéria de interesse quando existem outras bactérias crescendo na mesma placa de meio de cultura.  Ágar Sangue – rico em nutrientes e possui coloração vermelha intensa, é utilizado para cultivo primário de bactérias nutricionalmente exigentes. Como meio diferencial, é muito utilizado para a identificação tipo (padrão) de hemólise principalmente de bactérias de gênero Streptococus. Composição: Blood Ágar base, Columbia Ágar base, BHI Ágar, Mueller Hinton Ágar; Sangue desfribinado de carneiro ou coelho. Complexo –é indicado para o desenvolvimento de todos os microrganismos, possuem quantidades de nutrientes capazes de cultivar qualquer bactéria.  Ágar Nutriente – utilizado para o cultivo de uma ampla variedade de bactérias, tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras, possui baixo custo e é um meio relativamente simples, de fácil

5 f) Placa de Petri - facilita o isolamento de microrganismos devido à grande superfície de crescimento que apresenta, possibilitando o aparecimento de colônias separadas g) Erlenmeyer- utilizado para propagação celular de microrganismos em meio líquido sob agitação em mesa agitadora h) Vidro de relógio - é um pequeno recipiente redondo e côncavo usado para pesar pequenas quantidades de substâncias, para evaporar pequenas quantidades de soluções e para evaporar pequenas quantidades de soluções e para cobrir béqueres e outros i) Lâmina - para examinar microrganismos ao microscópio j) Lamínula - utilizada para recobrir preparações microscópicas “in vivo” k) Lamparina de vidro álcool com tampa e pavio l) Tubo de Duran – uso geral m) Espalhador de células formato L –serve para espalhar culturas de células uniformemente. n) Pinça anatômica ponta fina o) Micropipeta - para medição e transferência p) Swabs – cotonete estéril que serve para coleta de exames microbiológicos q) Pinça de Madeira Tipo Pregador p/ Tubo de Ensaio – indicado para pegar tubo de ensaio, lâminas e outros materiais r) Plataforma elevatória tipo Jack - Utilizada para posicionamento vertical de qualquer equipamento em laboratório s) Pisseta graduada - recipiente de uso laboratorial no qual se armazenam compostos de diversas naturezas t) Meios de cultura / Agar Sabourour u) Cristal Violeta, Lugol, Fucsina v) Água destilada w) Álcool 70% x) Fita identificação para autoclave

6 Figura 1 Mesa preparada para Coloração de Gram Fonte: arquivo proprio 1

4. MÉTODOS 4.1. Aula Prática I 4.1.1 Protocolo:Coloração de Gram Foi apresentados alguns tipos de meio de cultura, identificando suas caracteristicas e aplicações,conferido a relação dos materiais a serem utilizados na coloração de Gram, após a conferencia seguimos os seguintes passos:  Montou a alça de inoculação e Flambou para esterelizar, tendo o cuidado de deixar esfriar para não matar as bactérias na colheita;  Passou alcool 70% na placa e no calor da chama da lamparina, foi retirado uma amostra (delicadamenteco e com cuidado para pegar só a bactéria sem

8 Figura 3 Gram Positivo Fonte: arquivo proprio 3 Figura 4 Gram Negativa Fonte: arquivo proprio 4

9 Figura 5 Coleta bactéria para coloração de Gram Fonte: arquivo proprio 5 Figura 6 Flambando a Alça Fonte: arquivo proprio 6

11 Coletamos microrganismos utilizando o Swab, a coleta foi realizada no ambiente: banheiro, tampa da lixeira, tenis, celular, maçaneta da porta, bolor do pão. O material coletado foi colocado placas de Petri, identificados em fita e com filme de PVC, para serem analisados na proxima aula. 4.2. Aula Prática II A segunda aula prática abordou os seguites assuntos:  Fases de crescimento microbiano descrevendo as fases lag, fase log, fase estacionária e fase de morte;  Como conservar bactérias: na geladeira para desacelerar o crescimento, onde as bactérias irão cotinuar a crescer lentamente, controlado, para uma conservação mais longa deve se utilizar o ultrafreezer que zera o crescimento por meio do congelamento rápido, ou liofilizar, que é um equipamento portátil que suga toda água da bactéria transformando-a em pó, conservando até ser colocada em um meio de cultura para reativa-la. Pode ser utilizado o metodo de esgotamento para evitar a morte das bactérias, (sera testado na próxima aula prática.  Analisar os fungos e sua estrutura. 4.2.1. Material coletado na aula anterior  Microrganismos coletados na aula anterior: leveduras, fungos e bactéria;  A maioria das placas desenvolveu fungos;  Estruturas das hifas e esporos O fungo verde é altamente esporulante, o alo branco é a parte vegetativa do fungo. A bactéria brilha, é um diferencial que distingue da levedura.

12 Figura 9 Fungo colhido da tampa da lixeira Fonte: arquivo do autor Figura 10 observação no microscópio, com otima visualização das hifas Fonte: arquivo do autor

14 Figura 13 Esporulação do fungo da figura 7 Fonte: arquivo proprio 11 Figura 14 fungo coleta do meio ambiente Fonte: arquivo proprio 12

15 Figura 15 bactéria coleta do meio ambiente Fonte: arquivo proprio 13 Figura 16 fungo coletado do meio ambiente Fonte: arquivo proprio 14

17 A professora demonstou alguns meio de cultura e suas caracteristicas. Revertemos o meio de cultura Agar Sabourot seguindo as instruções do rótulo, 65 grs em 1 litro de água pura, utilizamos 16,25 gs para 250 ml de água pura. Foi colocado o meio e a água no Becker para dissolver mexendo com o bastão de vidro, aquecido e distribuido nas placas de Petri para serem esterilizados na autoclave. Foi apresentado o meio caldo com as suas caracteristicas conforme descrito abaixo: Formula Broch EC:  Triptose20 g - fornece nitrogênio, vitaminas e aminoácidos no Meio EC  Lactose. 5 g - fonte de carbono  Mistura de Sais Biliares 1,5 g - é o agente seletivo contra bactérias Gram- positivas, em particular bacilos e Streptococcus fecais  Fosfato Dipotássico 4 g - reagente tamponante  Fosfato Monopotássico 1,5 g - reagente tamponante  Cloreto de Sódio 5 g - mantém o equilíbrio osmótico do meio  Final pH: 6,9 ± 0,2 a 25°C Modo de Preparo 1. Dissolva 37 g do meio em 1 L de água purificada. 2. Misture completamente. 3. Distribua em tubos contendo tubos de Durham de fermentação invertida. 4. Autoclave a 121°C por 15 minutos. 4.3.2 Técnica de Esgotamento por Estriamento Simples e Estriamento Composto Consiste em isolar a cepa desejada por arrastamento sucessivo do microrganismo com a alça no meio de cultura. Tem a finalidade de identificação e classificação dos microrganismos.Segundo Tortora, é um método utilizado para isolar culturas puras de bactérias. a) Estriamento simples – com uma alça, foi retirado uma amostra de uma colonia e com a propria alça com movimento de zig-zag foi feito uma estria única na placa de Petri com o meio de cultura Ágar Sabourout;

18 b) Estriamento composto, foi feito 3 estriamentos na mesma placa, a cada estriamento a alça foi flambada e foi tocado na estria anterior para fazer a segunda e a terceira estria, conforme figura 19. Figura 19 Estriamento composto Fonte 1 Tortora 12. Ed. 4.3.3 Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos Foi retirado com a micropipeta uma amostra de bactéria já crescida em caldo, espalhada na placa de Petri com uma alça drigalski, e distribuido os discos ds