¡Descarga Biocel Microscopia y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!
BIOLOGIA CEL·LULAR
Tema 1-Microscòpia
Microscòpia Òptica (1400 augments màxim) -> utilitza els fotons Electrònica (major resolució) (+ augments) Imatge + nítida
- augments Utilitza electrons
- Microscopi òptic - llum – lents condensadors – mostra – lents objectius (revòlver) – prisma reflector – plànol focal – lents oculars (10-12 augments) – línia de visió
- Lents objectius x lents oculars = augments totals (fins a 100 x) (10-12 augm.)
Resolució: Capacitat per veure separades 2 estructures independents. Distància a la qual som capaços de veure-les separades.
0,61 x λ on: λ= longitud d’ona (modificable) *
D= n=índex de refracció n x sinα α= angle de llum en forma de con
D= distància **
- n x sinα : obertura numèrica - α angle màx.(αmàx) 90º característica de cada objectiu sinαmàx = 1 com + gran millor qualitat el millor α seria d’uns 70º aprox. no modificable
sin i vel. llum aire n= = = 1,5 (valor estàndard en el vidre) sin r vel. llum vidre
- Els augments útils en un microscopi serien l’obertura numèrica multiplicada per 1000 (és a dir, si l’obertura numèrica fos 14, serien 1400 augments).
* Com més petita es la longitud d’ona, + energètica és la llum i més resolució tindrà la imatge.
** Com més petita és la D (distància), més resolució tindrà la imatge.
- De vegades s’empra un oli d’immersió en les observacions microscòpiques del mateix índex de refracció que el vidre, per tal que tant la llum perpendicular com la obliqua arribi a la lent.
Per observar una mostra hem de fer un procés per tal d’observar-ho bé:
- Fixació. Per tal de fixar i mantenir qualitats. Opció: alcohol o formaldehid.
13SET2O
17SET2O
Les cèl·lules (estructures) queden mortes però fixades.
- Inclusió. Fer-ho rígid per tal de poder fer làmines homogènies. Opció: ceres o resines.
- (^) Tall. El tenim en un pot i fem seccions amb un micròtom (làmines d’acer). Les làmines es van movent i van donant mostres.
- Tinció. Colorants específics (de diversos colors per potenciar diferents parts) PD: Amb aquest procés mai observem cèl·lules vives. PD2: 2 fotons de la mateixa incidència, en travessar zones de la mostra de diferent gruix/ densitat, poden variar.
● Microscopi invertit amb contrast de fase
-S’utilitza per exemple en les clíniques de fertilitat per veure els embrions. -També hi ha microscopis al revés, amb la llum a dalt, d’aquesta manera la distància entre la mostra i les lents és més petita (sobretot utilitzat amb mostres gruixudes).
●Microscopi de contrast interferencial (DIC o Nomarski) En el qual podem observar fins i tot les mostres amb volum. El contrast amb els fotons dóna un resultat en volum. Ens permet visualitzar cèl·lules vives (no cal fer el procés anterior).
●Microscopi contrast de fase [El microscopi de contrast de fase és un microscopi que té un condensador especial en forma de xarxa cristal·lina que fa que els feixos lluminosos procedents de la font de llum es subdivideixin en infinits feixos que en arribar a la preparació contrasten millor els objectes a observar. Empra uns objectius especials de contrast de fase, com es senyala en els mateixos. Contràriament a la majoria de microscopis el feix de llum prové de la part superior mentre que l'objectiu és troba a sota la mostra, cosa que permet treballar-la fàcilment mentre s'observa la mateixa. La imatge que es forma ve donada per la diferència de fase que adopten els feixos lluminosos en passar per part més o menys denses de la mostra. Aquest microscopi permet observar estructures internes, però per això la mostra ha de ser molt fina. ]
●Microscopi de fluorescència (molts usos tb des del punt de vista clínic) Es basa en utilitzar molècules anomenades fluorocroms (que s’exciten segons quins fotons i emeten més). Alguns fluorocroms s’exciten i serveixen per marcar coses de la cèl·lula (es poden recuperar anticossos de malalties (?)). Anticossos immunofluoresncents, marcadors fluorescents per fer visibles determinades molècules o estructures cel·lulars. -Com funciona? Bombeta de fluorenscència -> 1r filtre (que només deixa passar certes longituds d’ona) -> -> la llum seleccionada arriba a un mirall que fa que la llum idònia es reflecteixi sobre la mostra -> passa per la lent objectiva -> posteriorment passa per un 2n filtre per tal que arribi només la llum que ens interessa El fons on hem de posar la mostra ha de ser negre
Marcatge fluorescent en anticossos i en DNA (sondes que reconeixen alguns cromosomes o gens) Fragments d’ADN que si s’escalfa es desnaturalitza
- FISH: Hibridació “in situ” fluorescent.
-El suport que la mostra sol utilitzar és un reixeta de coure. -Procés per observar les mostres al microscopi electrònic.
- Fixar la mostra gluteraldehid Tetraòxid de osmi
- Deshidratació
- Inclusió òxid de propilè (aquí el bloc és d’una mena de resina) 4.Tall. Aquí per tallar s’utilitza un ultramicròtom, amb les ganivetes de vidre o diamant, i fa seccions molt primes (de 100nm aprox.). Una vegada tallades, es dipositen les seccions sobre una superfície d’aigua. Col·loquen les mostres a la reixeta.
- Tinció amb metalls pesants Sals d’urani per les proteïnes Sals de plom i osmi per els lípids (membranes)
- (^) Tècniques microscòpia
◌ Contrast amb anticossos El contrast amb anticossos és semblant als fluorescents).
◌ Criomiscroscòpia electrònica Es submergeix la reixeta en l’aigua i es congela immediatament, i s’observa la mostra congelada. La imatge s’obté amb un fons uniforme i la imatge bé (s’obté sobretot en virus).
◌ Tinció negativa Submergir la reixeta (però no la mostra) en una dissolució de sals de metalls pesants. Els electrons no passaran on hi hagi metalls, només per on hi ha la mostra sense cobrir.
◌ Ombrejat Recobrim la mostra amb metalls pesants de forma obliqua. S’obté una espècie de motlle de la mostra en el metall (rèplica).
◌ Criofactura i gravat per congelació La mostra es congela i una màquina colpeja la mostra. S’ha vist que un “punt dèbil” de trencament entre la doble membrana, el que permet observar la mostra mes a fons, de manera més detallada. També ombrejat i replicació. Rèplica observada al microscopi feta de metall i carboni.
●Microscopi electrònic de rastreig/scanning (MES) Es recobreix la mostra també amb metalls pesants, però aquesta vegada la mostra queda exposada de manera perpendicular, de manera regular queda recoberta. Les mostres han d’estar mortes. Els sistemes per recollir les mostres són l’ombrejat (rastreig/escombrat). Les imatges que s’obtenen permeten reconstruir imatges d’una gran definició. A més, la imatge obtinguda sol ser la reproducció de la mostra en el metall, ja que en alguns casos fins i tot la mostra es dissol.
