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Departamento de Bioquímica
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid
Cuaderno de Prácticas de
Bioquímica General
Resultados, Preguntas y Problemas
Curso 2021-22
Apellidos: Santana Hernández
Nombre: Ana
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Cuaderno de Prácticas de Bioquímica General: Resultados, Preguntas y Problemas, Ejercicios de Bioquímica
Cuaderno de prácticas de bioquímica general del curso 2021-2022
Tipo: Ejercicios
2020/2021
1 / 15
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Departamento de Bioquímica
Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid
Cuaderno de Prácticas de
Bioquímica General
Resultados, Preguntas y Problemas
Curso 20 21 - 22
Apellidos: Santana Hernández
Nombre: Ana
Práctica 1. ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO: PROTEINOGRAMA
Resultados Pregunta ¿Se puede establecer un diagnóstico para los pacientes correspondientes a cada uno de los sueros analizados? Sí, observando los niveles de diversas proteínas de los sueros analizados podemos tener una idea de qué enfermedades padecen. El primer paciente es aparentemente sano pues los niveles de todas sus proteínas se encuentran dentro de los intervalos de referencia.
Práctica 2. UNIÓN DE LA HEMOGLOBINA A INTERCAMBIADORES DE IONES:
CROMATOGRAFIA
Resultados ¿Se ha unido la hemoglobina al DEAE-Sephadex a pH 8? Sí ¿Se ha unido la hemoglobina al CM-Sephadex a pH 6? Sí Preguntas Considerando los resultados obtenidos en relación a la unión de la hemoglobina a los intercambiadores de iones DEAE-Sephadex y CM-Sephadex, ¿qué información se puede deducir acerca del punto isoeléctrico de la hemoglobina? Considerando que la hemoglobina se ha unido al CM-Sephadex (intercambiador de cationes) a pH 6, teniendo carga positiva, y al DEAD-Sephadex (intercambiador de aniones) a pH 8, teniendo entonces carga negativa, podemos deducir que el punto isoeléctrico de la hemoglobina se encuentra entre los pHs 6 y 8, donde su carga neta será igual a cero. ¿Por qué se disuelve la hemoglobina en dos soluciones tamponadas a pHs diferentes para cada uno de los intercambiadores, DEAE-Sephadex o CM-Sephadex? Debido al carácter anfótero de las proteínas, estas se unen a intercambiadores de iones dependiendo del pH del medio. Sabemos que la hemoglobina tiene un punto isoeléctrico entre los pHs 6 y 8, por lo que a un pH inferior tendrá carga positiva, uniéndose a intercambiadores de cationes (CM-Sephadex), y a un pH superior tendrá carga negativa y se unirá entonces a intercambiadores de aniones (DEAD-Sephadex).
Práctica 3. ANALISIS ESTRUCTURAL DE LA INMUNOGLOBULINA G
Problema 1. Determinación del peso molecular de la inmunoglobulina G nativa por cromatografía de filtración en gel En una columna de filtración en gel se separó la siguiente mezcla de proteínas patrones: Proteína Pm (Dalton o u.m.a.) Tiroglobulina 670 000 Aldolasa 158 000 Ovoalbúmina 43 000 Mioglobina 17 000 El perfil de elución de las distintas proteínas se representa en la figura con línea discontinua. Tomando del perfil los volúmenes de elución de las distintas proteínas de Pm conocidos, construir la recta de calibrado que relaciona el volumen de elución con el log Pm. A continuación se aplicó la muestra de inmunoglobulina G nativa a la misma columna. Su perfil de elución se muestra en la misma figura con línea continua. Tomando del perfil el volumen de elución de la IgG nativa, interpolar su valor en la recta de calibrado y obtener el log Pm de la IgG nativa y calcular su Pm. Concentración de proteína Volumen de elución (ml)
Problema 2. Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) Problema 2 Representar en un papel milimetrado los valores de los log Pm de las proteínas marcadoras de Pm conocidos (en kDa) cargadas en el pocillo de la derecha, frente a sus distancias de migración (en cm) desde el inicio del gel separador. Trazar una recta de calibrado que pase por los puntos representados. A continuación, interpolar las distancias de migración de los polipéptidos (cadena A y cadena B) que componen la IgG, cargados en el pocillo de la izquierda y obtener sus log Pm. Con un calculadora, obtener a partir de estos valores de log Pm, los Pm (en kDa) de los polipéptidos que componen la IgG. Deducir el número de cadenas pesadas y de cadenas ligeras que componen una molécula de IgG nativa teniendo en cuenta los resultados del Problema 1 y del Problema 2. Proteínas Pm (kDa) Rf (mm) LogPm 180 3 2, 116 8 2, 84 12 1, 58 16 1, 48,5 19 1, 36,5 29 1, 26,6 33 1, IgG (CadenaA) 56,234 20 1, IgG (CadenaB) 19,953 36 1, In m unoglobulina G P roteínas m arcadora s
Pm (kDa)
Cadena pesada IgG Cadena ligera IgG Cadena A Cadena B
Pm IgG (2xCadenaA + 2xCadenaB) = 152,374 kDa Teniendo en cuenta los resultados del problema 1, conocemos que el peso molecular de la Inmunoglobulina G está en torno a los 158 kDa. Utilizando los datos obtenidos del segundo problema, nos percatamos de que, si multiplicamos el peso molecular de las cadenas A y B de la IgG por 2 y las sumamos, el peso molecular total es cercano a 152 kDa. Los pesos moleculares de los dos problemas son muy similares, pues se entiende que exista un pequeño margen de error en los estudios realizados. Por ello, deducimos que una molécula de Inmunoglobulina G está formada por 2 cadenas pesadas (A) y 2 cadenas ligeras (B). 0
1
2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 LogPm Rf (mm) Recta patrón: Logaritmo del peso molecular frente a la movilidad electroforética
1.1. Datos
Tubo moles pN A 420
1.2. Representación de A420 frente a moles de pN
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0. A moles pN Recta patrón: Absorbción frente a concentración de pN
2. Representar la velocidad del enzima ( v ) frente a las diferentes concentraciones de sustrato
pN P ( [S] )
Interpolar la A420 de cada tubo del Protocolo 2 en la recta patrón anterior para obtener los
moles de producto pN generados en las reacciones con distintas concentraciones de sustrato
Calcular las diferentes velocidades del enzima del enzima ( v ) en las distintas concentraciones de
sustrato pNP
v = moles de producto pN / 10 min de reacción
Para calcular las diferentes concentraciones de sustrato hay que saber cuántos moles de sustrato
pNP se han diluido en el Volumen de reacción ( 3 ml )
moles de sustrato pNP = Concentración molar de sustrato pNP x Volumen de sustrato pNP
= 3 mM x ( 0,1 ó 0,2 ó 0,3 ó 0,5 ó 0,8 ó 1,2 ml )
Concentración de sustrato pNP = moles de sustrato pNP / Volumen de reacción
= 3 mM x ( 0,1 ó 0,2 ó 0,3 ó 0,5 ó 0,8 ó 1,2 ml ) / 3 ml = 0,1 ó 0,2 ó 0,3 ó 0,5 ó 0,8 ó 1,2 mM
Representar las velocidades del enzima ( v ) frente a las concentraciones de sustrato pNP ( [S] )
v
S
3. Representar 1 / v frente a 1 / [S]
Calcular los valores de 1 / v ( min / moles de producto pN ) para cada 1 / [S] ( mM-^1 )
Representar los valores de 1 / v ( min / moles de producto pN ) para cada 1 / [S] ( mM-^1 ) y
calcular los valores de K M ( mM ) y V max ( moles de producto pN min )
3.1. Datos
1 / [S] , mM-^1 1 / v , (moles pN)-^1 min
1 / v
1 / [S]
1 / V max
- 1 / K M
3.2. Representación de 1 / v frente a 1 / [S]
- 0 50 100 150 200 250 -15 -10 -5 0 5 10 15 1 / v , ( moles pN ) -^1 min 1 / [S] , mM-^1 Representación de 1/v frente a 1/[S]