¡Descarga Microscopia y más Ejercicios en PDF de Biología solo en Docsity!
MICROSCOPI ÒPTIC
Descripció bàsica
El microscopi és un instrument òptic format per un sistema de lents que dóna lloc a imatges virtuals i augmentades d’ objectes molt petits, consta de dues parts:
Components òptics: formen la imatge
- Ocular
- Objectiu
- Condensador Components mecànics: subjecten els components òptics
- Peu o base
- Braç o columna
- Tub o capçal
- Altres
Formació d’imatge i augment
Essencialment el microscopi compost , anomenat normalment microscopi consta de dos sistemes òptics: objectiu i ocular, situats als extrems d’un tub amb un eix òptic comú. L’objecte que s’estudia se situa davant i a prop del pla focal de l’objectiu, així s’obté una primera imatge real augmentada i invertida de l’objecte anomenada imatge primària del microscopi. L’ocular forma la imatge final virtual, més gran i dreta, de la imatge primària situada a la distància mínima de visió distinta o perfecta – aproximadament a 250 mm de l’ull de l’observador.
La distància que hi ha entre l’objectiu i l’ocular està relacionada amb el nombre d’augments que té la imatge ampliada, com més gran és aquesta distància, més gran és la imatge final.
En el microscopi compost l’augment final és el resultat de dues amplificacions o dos augments parcials, un en l’objectiu i l’altre, el de l‘ocular. El producte d’aquestes dues quantitats és l’augment total del microscopi, que equival a la relació entre les dimensions de l’objecte i de la imatge final.
Components òptics
1. L’objectiu
És un sistema de lents convergents situat a l’extrem inferior del tub del microscopi que té com a finalitat obtenir una imatge real, augmentada i invertida de l’objecte.
Els objectius es troben formats per sistemes complexos de lents (doblets i triplets) que s’utilitzen per corregir les aberracions geomètriques (esfericitat, astigmatisme, coma, distorsió i curvatura del camp) i cromàtiques inherents a les lents úniques.
Classificació segons el grau de correcció cromàtica :
Acromàtics: lents de vidre Semiapocromàtics: lents de vidre i fluorita. Apocromàtics (lents de fluorita): generen imatges nítides i de qualitat.
Classificació segons els augments:
Petit augment : (x4, x10) Mitjà augment : (x40, x60) Gran augments : (x100)
Classificació segons què hi ha entre el porta el cobre :
Objectius secs: quan entre el cobreobjectes i l’objectiu hi ha l’aire
La resolució màxima del microscopi òptic és de 0,25 μm, mentre que la de l’ull humà és de l’ordre de 0,15 mm. Poder d’il·luminació: és la quantitat de llum que entra en l’objectiu per formar la imatge. Camp visual: És la zona de la mostra que pot ésser observada sense moure-la ni canviar l’enfocament. Poder de penetració o profunditat de focus : és la capacitat d’un objectiu per enfocar de forma simultània diferents plans de la mostra. Els dos primers factors varien en proporcionalitat directa amb l’obertura numèrica, en canvi els dos últims varien en proporcionalitat inversa. Gruix del portaobjectes 1mm i gruix del cobreobjectes 0,17mm
- Longitud que hi ha entre el ocular i l'objectiu
2. Ocular
És un sistema òptic que, situat en l’extrem superior del tub del microscopi, dóna lloc a una imatge virtual, augmentada i dreta, de la imatge primària originada per l’objectiu. Els oculars poden ser positiu s amb el pla focal exterior al sistema òptic, i negatius amb el pla focal interior. S’anomenen oculars compensadors quan acaben de corregir l’aberració cromàtica residual que presenta la imatge primària.
En els oculars, s’ha de tenir en compte, a més a més de l’augment, l’anomenat índex de camp visual, que indica l’àrea de la imatge primària visualitzada per l’ocular. Els valors numèrics tant d’un com de l’altre es troben gravats en la muntura de l’ocular.
3. Sistema d’il·luminació
Dispositiu que facilita la il·luminació correcta de la mostra per a una acurada observació microscòpia. Generalment consta de: focus lluminós (làmpada), lent col·lectora, mirall i condensador amb diafragma d’obertura. Condensador: és un sistema de lents convergents situat a sota de la platina que concentra damunt de la mostra els feixos de llum emesos per la font d’il·luminació. Està equipat amb un diafragma iris (diafragma d’obertura) que permet controlar el con de llum incident sobre la mostra per millorar el contrast de la imatge microscòpica. El condensador és l’element bàsic d’alguns tipus d’il·luminació especials en microscòpia com és el cas del camp fosc i del contrast de fase que utilitzen condensadors especials. Tancar el diafragma observant mostres sense tenyir i sense color propi permet veure un millor contrast.
Components mecànics
1. Peu
Té com a missió sostenir l’instrument de la manera més estable possible. La seva massa contribueix a esmorteir les vibracions.
2. Columna
Serveix de suport al tub o capçal a més de la platina i subplatina.
3. Tub o capçal
Estructura cilíndrica que té en els seus extrems l’objectiu i l’ocular, entre els quals condueix el feix de llum. Els tubs poden ser monoculars o binoculars, segons el nombre d’oculars inserits. La seva longitud òptica, que no ha de coincidir necessàriament amb la longitud mecànica, es de 160 o 170 mm. S’entén per longitud òptica la distància que ha de recòrrer la llum des de la sortida de l’objectiu fins l’ocular.
4. Revòlver
Dispositiu rotatori que sosté els objectius i que permet intercanviar-los i centrar-los amb amb l’eix òptic.
5. Platina
Superfície plana inserida perpendicularment a l’eix òptic on se situa la preparació; normalment té incorporat un dispositiu que permet el desplaçament de la preparació en les direccions dels eixos X-Y, de manera que en facilita l’observació.
6. Subplatina
Part mecànica que subjecta el condensador.
albúmina o gelatina de Mayer. En el cas de la inclusió amb parafina s’ha de retirar després amb un dissolvent orgànic.
6. Hidratació: banys d'etanol en concentracions decreixents perquè els colorants són de natura hidrosoluble. 7. Tinció: les cèl·lules que conformen els teixits són pràcticament incolores i han de ser necessàriament tenyides.
Els colorants actuen com a colorants àcids o com a colorants bàsics i donen lloc a unions salines similars amb radicals ionitzables presents en els teixits. Els components dels teixits que es tenyeixen amb els colorants bàsics s’anomenen basòfils i en són un exemple els àcids nucleics que formen el nucli de les cèl·lules. Els teixits que es tenyeixen amb els colorants àcids s’anomenen acidòfils , com per exemple el citoplasma.
Colorants bàsics : hematoxilina, blau de toluïdina (sang) i blau de metilè. S’uneixen a estructures basòfiles com són els nuclis cel·lulars per la presència d’àcid desoxiribonucleic (DNA).
Colorants àcids: eosina i fucsina àcida.Tenyeixen principalment les proteïnes
citoplasmàtiques.
La combinació de 2, 3 o més colorants en forma de mescles tintorials és d’ús molt freqüent i dona lloc als mètodes de doble tinció. Permeten visualitzar alhora els components àcids i bàsics d’un mateix teixit. L’hematoxilina i l’eosina són els més utilitzats.
Després de ser tenyides i diferenciades, convé aclarir les preparacions amb essències ( ex: essència d’orenga, de bergamota, de cedre...).
S’utilitzen també impregnacions metàl·liques amb sals de plata i or per l’estudi de cèl·lules nervioses.
La immunofluorescència utilitza anticossos específics per a la proteïna a estudiar units amb fluorocrom per tal de poder observats amb un microscopi de fluorescència.
8. Muntatge: d esprés de tenyides i diferenciades les preparacions, convé aclarir-les
amb una essència (essència d’orenga, de bergamota, de cedre, ...) per poder-les
muntar amb bàlsam del Canadà, reïna Dammar o DPX. De vegades, com és el cas
de l’estudi de substàncies lipídiques, és convenient no deshidratar i utilitzar medis
de muntatge hidrosolubles com la glicerina, la glicerina-gelatina, o, fins i tot,
l’aigua.
La sang
La sang és un teixit conjuntiu líquid lleugerament alcalí (pH=7,4), viscós i de color vermell, que circula per l’aparell cardiovascular. La sang està constituïda per les cèl·lules sanguínies (eritròcits, leucòcits i plaquetes) i pel plasma que és una matriu extracel·lular líquida, rica en proteïnes i metabòlits.
EXTENSIÓ O FROTIS SANGUINI
La morfologia de les cèl·lules sanguínies s’estudia habitualment en frotis, també anomenat extensió. Consisteix en fer una extensió molt fina d’una gota de sang damunt d’un portaobjectes. En els frotis, les cèl·lules queden esteses i separades de manera que es facilita l’observació de la seva morfologia amb el microscopi.
Mesures en microscòpia
Amb l’ajut de diferents aparells podem obtenir, a més de resultats morfològics, valoracions de tipus quantitatiu, com la mesura de longituds, de diàmetres, de superfícies, de densitats numèriques (recomptes, nombre de cèl·lules per unitat de volum, etc.). Actualment s’utilitzen sistemes de captació, digitalització i anàlisis d’imatges que permeten obtenir de manera semiautomàtica valors morfomètrics.
1. Mesura de distàncies horitzontals (micrometria)
Una manera fàcil de mesurar les cèl·lules i estructures que visualitzem al microscopi és utilitzar el micròmetre ocular o ocular micromètric. Es tracta d’un disc de vidre que porta gravada una petita escala i que es col·loca dins de l’ocular. El valor de cada divisió de l’escala, pel fet d’estar situada a nivell de l’ocular, varia en funció de l’augment amb què s’observa. Per tal de saber el valor de cadascuna de les divisions a un determinat augment, es compara l’escala de l’ocular amb la del micròmetre de platina, micròmetre objectiu o micròmetre objecte , de la qual sabem el valor real. Aquesta operació, rep el nom de calibratge del micròmetre ocular. El micròmetre objecte és una preparació que porta gravat, generalment, un mil·límetre dividit en 100 parts - el portaobjectes ens ho indica: 1/100, 1:100, 0.01 mm.
Per mesurar la longitud de qualsevol mostra només s’ha de substituir el micròmetre d’objecte per la preparació objecte, observar el nombre de divisions que abasta la mostra i multiplicar-ho pel valor de cadascuna de les divisions ( L ).
Figura 2.1. Cèl·lules de la sang: H, hematia o eritròcit; L, limfòcit; LG, limfòcit gran; M, monòcit; N, neutròfil; E, eosinòfil; B, basòfil; P, plaquetes o trombòcits
5. Microscòpia electrònica de rastreig (mer)
És aquell que té el transmissor a la part exequimal del lent (Objectiu 4x). Aquest microscopi utilitza una sonda que recorre la superfície de l'objecte a estudiar.
Genera imatges en relleu i en blanc negre.
Comparació microscopi òptic i electrònic
