Cinetica Enzimatica, Notas de estudo de Química Industrial

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JULIANA RIBEIRO MARIOTTO

ESTÁGIO DE DOCÊNCIA

Cinética Enzimática

JULHO 2006

CINÉTICA ENZIMÁTICA

A Cinética de Reações Enzimáticas apresentam os seguintes objetivos:

• Medir as velocidades das transformações que se processam;
• Estudar a influência de condições de trabalho (concentrações de reagentes e das enzimas, temperatura, pH, concentrações de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades;
• Correlacionar (equações empíricas ou modelos matemáticos) as velocidades das transformações com alguns dos fatores que as afetam;
• Colaborar na otimização do processo;
• Estabelecer critérios para o controle do processo;
  • Projetar o reator mais adequado.

1 Influência da concentração de substrato

Um dos fatores que afetam a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima purificada é a concentração do substrato presente [S]. O estudo dos efeitos da concentração de substrato é complicado pelo fato de a [S] variar durante o curso de uma reação à medida que o substrato é convertido em produto. Uma forma de simplificar este problema é medir a velocidade inicial da reação ( V 0 ). Em um experimento cinético a [S] é sempre muito maior que a concentração da enzima [E], e se o tempo de reação é suficientemente curto, as mudanças da [S] serão negligenciáveis, podendo ser considerada como uma constante.

O efeito provocado em V 0 pela variação da [S], quando a concentração de enzima é mantida constante está mostrado na Figura 1. Em concentrações pequenas do substrato, V 0 aumenta quase linearmente com os aumentos de [S]. Em concentrações maiores de substrato V 0 aumenta por incrementos menores em respostas aos aumentos da [S]. Finalmente, é alcançado um ponto acima do qual ocorrem apenas aumentos insignificantes em V 0 , mesmo diante de aumentos em [S], sendo este ponto chamado de velocidade máxima ( Vmáx ).

O perfil cinético apresentado na Figura 1 levou Victor Henri a propor, em 1903, que uma enzima liga-se à molécula de seu substrato para formar o complexo ES, sendo este um passo obrigatório no processo catalítico enzimático. Esta idéia foi expandida em uma teoria geral da ação das enzimas, especialmente por Leonor Michaelis e Maud Menten, em 1913. Eles propuseram que a enzima primeiro combina-se reversivelmente com o substrato, para formar o complexo enzima-substrato, em um passo reversível relativamente rápido:

k 1 E + S ES (1) k-

A seguir, em um passo mais lento, o complexo ES se rompe com o reaparecimento da enzima livre e a formação do produto da reação P:

k 2 ES E + P (2)

A segunda reação (Equação 2) é mais lenta neste modelo e, portanto, limita a velocidade da transformação global do reagente em produto. Disto resulta que a velocidade da reação enzimática deve ser proporcional à concentração da substância reagente no segundo passo, ES.

Em qualquer instante de uma reação, a enzima existe em duas formas, a não ligada ao substrato, ou a forma livre E, e a forma ligada ES. Em concentrações pequenas do substrato [S], a maior quantidade da enzima estará na forma livre E. Nestas condições, a velocidade de reação será proporcional à [S] porque o equilíbrio da Equação 1, à medida que [S] aumentar, será deslocado na direção da formação de mais ES. A velocidade inicial máxima da reação ( Vmáx ) será atingida quando praticamente todas as moléculas da enzima estiverem na forma do complexo ES, e a concentração da enzima livre E é insignificante. Neste caso, diz-se que a enzima está “saturada” com o substrato e a velocidade da reação não aumenta mais com os aumentos de [S]. Em solução contendo um excesso de substrato, haverá um período cinético inicial chamado de estado pré-estacionário, ocorrendo o crescimento da concentração de ES. O estado pré-estacionário é, usualmente, de duração muito curta. A reação atinge o estado estacionário muito rapidamente e a concentração do complexo [ES] permanecerá praticamente constante durante o decorrer do tempo.

1.1 Equação de Michaelis e Menten

A Figura 1 mostra a relação entre [S] e V 0 para uma reação enzimática. A curva que expressa esta relação possui a mesma forma para a maioria das enzimas, sendo expressa pela Equação de Michaelis e Menten, derivada por estes pesquisadores partindo de sua hipótese básica de que, nas reações enzimáticas, o passo limitante da velocidade é a quebra do complexo ES para formar o produto e a enzima livre.

A Equação de Michaelis-Menten (Equação 3) é a equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato. É uma expressão da relação quantitativa entre a velocidade inicial V 0 , a velocidade inicial máxima Vmáx , e a concentração inicial de substrato [S], todas relacionadas através da constante de Michaelis-Menten, Km. A constante de Michaelis-Menten é uma constante dinâmica, ou de pseudoequilíbrio, que expressa a relação entre as concentrações reais no estado estacionário ao invés de concentrações no equilíbrio.

[ ] K [ ] S

V V S

m

máx 0 = + (3)

Uma relação numérica importante emerge da Equação de Michaelis-Menten no caso especial quando V 0 é exatamente metade de Vmáx (Figura 1). Então:

K (^) m = [ S ]→ V (^) 0 = 12 Vmáx (4)

Km é equivalente à concentração de substrato na qual V 0 é igual à metade de Vmáx , e indica a “afinidade” de uma enzima pelo seu substrato. Quanto menor for o valor de Km , maior será a afinidade da enzima pelo substrato.

Obs: Vmáx depende do k 2 , que é uma constante, e da concentração da enzima na experiência realizada. Vmáx é proporcional à concentração da enzima (Figura 3).

k 1 k 2 E + S ES E + P (5) k-

A Vmáx também varia muito de uma enzima para outra. Se uma enzima reage pelo mecanismo de dois passos de Michaelis-Menten, a Vmáx é equivalente a k 2 [Et], onde k 2 é o passo limitante da velocidade. Entretanto, o número de passos da reação e a identidade do(s) passo(s) limitante(s) da velocidade podem variar de enzima para enzima.

Exemplo: Liberação do produto EP E + P é limitante da velocidade.

k 1 k 2 k 3 E + S ES EP E + P (7) k-1 k-

Na saturação, a maior parte da enzima está na forma EP e V (^) máx = k 3 [ Et ]. Portanto

pode-se definir a constante k (^) cat para descrever a velocidade limitante de qualquer reação catalisada por uma enzima nas condições de saturação.

Cada enzima tem valores ótimos de k (^) cat e Km que refletem o ambiente celular, a concentração do substrato normalmente encontrado in vivo pela enzima e a química da reação que está sendo catalisada.

1.1.2 Ordem da reação

1.1.2.1 Primeira ordem

• Ocorre quando [S] << K (^) m [ ] m

máx K

V = V S

Considerando Vmáx^ Km = k :

V (^) 0 = k [ S ] (9) Onde:

k : constante de velocidade de primeira ordem (min-1^ ).

A Equação 9 indica que quando [S] é muito pequena, a velocidade absoluta diminui a cada momento, à medida que [S] decresce (Figura 4). Porém, em um certo momento, uma fração constante de substrato presente se transforma em produto:

[ ] (^) V k [ ] S dt − d^ S = 0 =

[ ] [ ] S dt k = − dS ⋅^1 (10)

Como V 0 diminui com o tempo na região de primeira ordem, gráficos de [S] e [P] contra o tempo são curvos (Figura 5). Pode-se determinar a quantidade de substrato utilizada ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo utilizando a equação integrada de velocidade de primeira ordem, cujo resultado será:

[ ] [ ] (^0 ) 2 , 3 log^0 kt t S

⋅ S^ = − (11)

Figura 4. V 0 diminui continuamente com o tempo.

Figura 5. Aparecimento de [P] e desaparecimento de [S] não são lineares com o tempo.

1.1.2.3 Lineweaver-Burk

Uma transformação muito empregada é obtida de forma simples, invertendo-se os dois lados da Equação de Michaelis-Menten:

máx^ [ ]^ máx

m V S V

K

V

• Gráfico: (^1) V^ contra (^1) S ;
• A linha reta tem inclinação igual a máx

KmV , o intercepto no eixo (^1) V^ é igual a Vmáx

e o

intercepto no eixo [ ]

1 S

é igual a Km

• Vantagem: permitir uma determinação acurada de Vmáx , o que pode ser feito apenas aproximadamente em gráficos de V versus [S].

Figura 7. Gráfico duplo-recíproco ou de Lineweaver-Burk.

1.1.2.4 Método de Hanes

Consiste simplesmente em multiplicar por [S] ambos os membros da Equação 14. [ ] (^) [ ] S V V

K

V

S

máx máx

= m^ +^1 (15)

• [^ S ] V varia linearmente com [S];
• A linha reta tem inclinação igual a (^1) V^ máx , o intercepto no eixo [^ S ] V é igual a K^ mVmáx e

o intercepto no eixo [S] é igual a – Km.

Figura 8. Gráfico de Hanes.

1.1.2.5 Método de Eadie-Scatchard

Rearranjando e multiplicando por (^1) [ ]^ S os dois lados da Equação 3, obtém-se:

[ ] S

V V K V

= (^) máx − m (16)

• Gráfico: V versus V^ [ ] S ;
• A linha reta tem inclinação igual a − Km , o intercepto no eixo V é igual a V (^) máx e o

intercepto no eixo V^ [ S ]é igual a V^ máxKm.

• A linha reta tem inclinação igual a − (^1) Km , o intercepto no eixo (^2) t ,^3 ⋅ log[ ][ ] SS^0 é igual

a V^ máxKm e o intercepto no eixo ([^ S^ ]^0 −[ ] S ) t é igual a Vmáx.

Figura 10. Gráfico da forma integrada da Equação de Michaelis-Menten.

Exemplo: Os valores da Tabela 4 mostram a velocidade inicial de formação do produto para diversos valores de concentração inicial do substrato em uma reação enzimática (Figura 11).

Tabela 1. Velocidade inicial de formação do produto em função da concentração inicial de substrato. [S] (g/L) V 0 (g/L.h) 0,25 0, 0,51 1, 1,03 1, 2,52 2, 4,33 2, 7,25 2,

0,

1,

2,

3,

0 2 4 6 8 [S] (g/L)

Vo (g/L.h)

Figura 11. Representação gráfica dos valores da Tabela 1.

Aplicando-se, aos valores da Tabela 1, o método de Lineweaver-Burk e o de Hanes, obtêm-se os resultados representados, respectivamente, nas Figuras 12 e 13.

y = 0,228x + 0, R^2 = 0, 0,

0,

0,

1,

1,

0 1 2 3 4 5 1/[S] (L/g)

1/Vo (L.h/g)

Figura 12. Determinação de V 0 e K (^) m pelo método de Lineweaver-Burk.

• Resultados →

[ ]

[ ]

L

K g V

K

L h V g V

V S

V S V

K

V

máxm m

máx máx

máx máx

m

Portanto,

0

0

substrato e inibidor competitivo; (2) da afinidade diferencial da enzima pelo substrato e pelo inibidor. Por suas características, a inibição competitiva é bastante específica.

Figura 14. Inibidores competitivos.

Como o inibidor se liga reversivelmente à enzima a competição pode se tornar favorável ao substrato, pela simples adição ao meio de reação de mais substrato, tornando mínima a probabilidade de uma molécula de inibidor se ligar à enzima. A reação, neste caso, exibirá uma Vmáx normal. Entretanto, o valor de Km aumentará na presença do inibidor. Este efeito no Km aparente e a ausência de um efeito em Vmáx são diagnósticos da inibição competitiva e é facilmente revelado através de um gráfico duplo-recíproco.

A Figura 15 mostra um conjunto de gráficos duplo-recíproco obtidos na ausência do inibidor e em duas concentrações diferentes de um inibidor competitivo. O aumento de [I]

resulta na produção de uma família de linhas com intercepto comum no eixo (^1) V 0 , mas com

inclinações diferentes. Devido ao intercepto no eixo (^1) V 0 ser igual a (^1) V^ máx observa-se que a

velocidade máxima não muda quando a reação ocorre na presença de um inibidor competitivo, isto é, em uma dada reação enzimática sempre haverá uma concentração tão alta de substrato que deslocará o inibidor competitivo do sítio ativo da enzima, não importando quão alta seja a concentração do mesmo.

Figura 15. Gráfico duplo-recíproco da inibição competitiva.

• Equação de Michaelis-Menten com a presença de um inibidor competitivo:

[ ] [ ] (^) [ ] S K

K I

V V S

m I

máx ⎜⎝⎛^ + ⎟⎠⎞^ +

• Aplicando-se o método de Lineweaver-Burk na Equação 19 (Figura 16):

[ ] V [ ] S

K

K I

V V máx

m I máx

• Determinação de KI :

Figura 16. Determinação de KI.

As Equações (3) e (19) permitem calcular a relação entre as velocidades da reação sem inibidor e com inibidor:

se pode prever que Vmáx será menor que a Vmáx observada na ausência de inibidor. Em geral, o efeito sobre Km é pequeno ou nenhum.

Figura 18. Inibição não competitiva.

• A equação da velocidade é dada por: [ ] [ ] (^) [ ] [ ] ⎟⎟⎠

+ ⎛^ +

m I I

máx K

S I

K

K I

V V S

• Aplicando o método de Lineweaver-Burk na Equação 21: [ ] [ ]

[ ] ⎟⎟⎠

+ ⎛^ +

= ⎛^ +

máx I máx I

m K

I

K S V

I

V

K

V^1

Na inibição não competitiva, gráficos construídos com os valores de velocidade obtidos experimentalmente produzem a família de linhas mostrada na Figura 19, com

intercepto comum no eixo (^1) [ ]^ S. Isto indica que Km para o substrato não é alterado por um

inibidor não competitivo, mais Vmáx diminui.

Figura 19. Gráfico duplo-recíproco da inibição não competitiva.

2.3 Inibidores reversíveis incompetitivos

Trata-se de uma inibição por bloqueio do complexo ES. Supõe-se que existam na enzima dois sítios ativos: um reservado ao substrato e outro ao inibidor, mas este último só pode se fixar de modo reversível sobre o complexo intermediário ES (Figura 20).

Figura 20. Inibição incompetitiva.

A associação enzima-inibidor é não exclusiva. O inibidor não permite ao complexo ternário ESI evoluir para elaborar o produto. Neste tipo de inibição, a velocidade máxima ( Vmáx ) e Km são menores que na ausência de inibidor.

• A equação da velocidade é dada por: